Белок орс 4
Длина последовательноси 417 аминокислот
Альфа спирали(Hh)- 61.39%
Бета нити (Ee)- 14.39%
Бета листы(слои)(Tt) - 4.08%
Случайные клубки (Cc) - 20.14%
Рисунок 4 – Графическое изображение элементов вторичной структуры белковой последовательности ОРС 4
Белок орс 7
Длина последовательности 181 аминокислот
Альфа спирали (Hh) - 51.38%
Бета нити (Ee) - 18.78%
Бета листы(слои) (Tt) - 4.97%
Случайные клубки (Cc) - 24.86%
.
Рисунок 5 – Графическое изображение элементов вторичной структуры белковой последовательности ОРС 7
Белок орс 8
Длина последовательности 274 аминокислот
Альфа спирали(Hh) - 50.36%
Бета нити (Ee) - 9.85%
Бета слои (Tt) - 2.92%
Случайные клубки (Cc) - 36.86%
Рисунок 6 - Графическое изображение элементов вторичной структуры белковой последовательности ОРС 8
3.5 При помощи программы Phyre ver.2.0 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/) мы смоделировали третичную структуру возможных белковых продуктов.
Белок орс 4
Рисунок 7 – Третичная структура белкового продукта ОРС 4
Белок орс 7
Рисунок 8 – Третичная структура белкового продукта ОРС 7
Белок орс 8
Рисунок 9 – Третичная структура белкового продукта ОРС 8
3.6 Построили филогенетическое дерево, отображающее систематическое положение организма. Для построения использовали программу Phylogeny.Fr (http://www.Phylogeny.Fr/version2_cgi/simple_phylogeny.Cgi)
Рисунок 10 – Филогенетическое дерево
4. Праймеры для трех самых длинных ОРС подбирались вручную, так чтобы ампликон содержал всю последовательность ОРС, и далее анализировались в программе Primer‑BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer‑blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome).
Таблица 1 –Последовательности прймеров и параметры ПЦР реакции для ОРС 4
Праймеры |
Последовательность праймера |
Длина ДНК |
Длина праймеров |
%ГЦ |
Темп. Плавления |
Время элонгации |
Прямой |
AGCATTTTCCCCTAAACAAA |
1295(ампликон) 1254(ОРС) |
20 |
35,00 |
53,20 |
1,3 мин (из расчета 1мин на 1000 п.о.) |
Обратный |
CAACTTAACAGATGTACAACAAC |
23 |
34,78 |
54,22 |
Таблица 2 –Последовательности прймеров и параметры ПЦР реакции для ОРС 7
Праймеры |
Последовательность праймера |
Длина ДНК |
Длина праймеров |
%ГЦ |
Темп. Плавления |
Время элонгации |
Прямой |
GCGCAGTTTCGATTAAGAAG |
897(ампликон) 825 (ОРС) |
20 |
45,00 |
55,51 |
0,9мин (из расчета 1мин на 1000 п.о.) |
Обратный |
AACCACTAAATATGGCTGCT |
20 |
40,00 |
54,69 |
Таблица 3 –Последовательности прймеров и параметры ПЦР реакции для ОРС 8
Праймеры |
Последовательность праймера |
Длина ДНК |
Длина праймеров |
%ГЦ |
Темп. Плавления |
Время элонгации |
Прямой |
CGCGACATATCTCTAAGCAA |
590(ампликон) 546 (ОРС) |
20 |
45,00 |
55,49 |
0,59мин (из расчета 1мин на 1000 п.о.) |
Обратный |
TAACTTGAGGTCTTACGTGG |
20 |
45,00 |
54,46 |
Для полимеразы Tag SE время элонгации принимают равным одной минуте (60 секунд) на каждую тысячу пар оснований.
Для проведения ПЦР требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать, праймеры- короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК, термостабильная ДНК-полимераза— фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.
Прогрмамма ПЦР реакции:
1.Предварительный прогрев реакционноной смеси-около 5 мин до 94 С.
2. Вводят термостабильную полимеразу и еще раз прогревают в течение 30 сек. До полной денатурации ДНК при 94-96 С
3. Далее для отжига температуру понижают до температуры на 4-5С ниже температуры плавления праймеров. Время стадии около 30 сек.
4. Далее доводят температуру до значения оптимального для работы Taq-полимеразы – активна при 72 С. Время элонгации для Taq-полимеразы принимают равной минуте на каждую тысячу пар осований
5. Стадия финальной элонгации для достройки одноцепочечных фрагментов – 7 мин, темп. – 72 С.
ПАРАМЕТРЫ ПЦР
ОРС 4 |
ОРС 7 |
ОРС 8 |
|
|
|
|
2) 30 сек – 94 С |
2) 30 сек – 94 С |
|
3)30 сек – 54,95 С |
3) 30 сек – 54,97 |
4). 1, 29 мин – 72С |
4). 54 сек – 72 С |
4). 35 сек – 72 С |
5). 5 мин – 72 С |
5). 5 мин – 72 С |
5). 5 мин – 72С |
2-4 стадии-25-30 циклов |
2-4 стадии-25-30 циклов |
2-4 стадии-25-30 циклов |
|
|
|
|
|
|
Время эллонгации для каждого ОРС высчитывали при помощи пропорции:
ОРС 4: 1мин – 1000пар оснований ОРС 7: 1мин – 1000 пар
Х мин – 1295 х мин – 897
Х=(1*1000)/1295 х=897*1/1000
х=1,3 мин х=0,9 мин
ОРС 8
1 мин – 1000 пар
Х мин - 590
Х=1*1000/590
Х=0,59 мин