Практическое применение бактериофагов.
Фаги используются для тестирования бактерий, а в ряде случаев для их индикации(выявления) в окружающей среде. Кроме того они применяются для лечения и профилактики ряда инфекционных заболеваний.
В практке эпидемического обследования применяется фаготипирование бактерий – метод дифференцирования их внутри вида для определения фаготипа.
1995 г – Тимаков и Гольдфарб – новый метод выявления патогенных микроорганизмов непосредственно в исследуемом материале, без выявления чистой культуры. Этот метод, названный реакцией нарастания титра фага, основан на способности индикаторного фага к репродукции в чувствительных бактериях. При внесении такого фаг в исследуемый материал, соержащий искомый вобудитель, определяется нарастание ттра фага.
Билет №12
1. Основной таксономической единицей систематики бактерий является вид.Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками.Вид не является конечной единицей систематики. Внутри вида выделяют варианты микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками. Так, различают:1) серовары (по антигенной структуре);2) хемовары (по чувствительности к химическим веществам);3) фаговары (по чувствительности к фагам);4) ферментовары;5) бактериоциновары;6) бактериоциногеновары.
Бактериоцины – вещества, продуцируемые бактериями и губительно действующие на другие бактерии. По типу продуцируемого бактериоцина различают бактериоциновары, а по чувствительности – бактерициногеновары.
Для видовой идентификации бактерий необходимо знать следующие их свойства:
1) морфологические (форму и структуру бактериальной клетки);2) тинкториальные (способность окрашиваться различными красителями);3) культуральные (характер роста на питательной среде);4) биохимические (способность утилизировать различные субстраты);5) антигенные.
Виды, связанные генетическим родством, объединяют в роды, роды – в семейства, семейства – в порядки. Более высокими таксономическими категориями являются классы, отделы, подцарства и царства.Согласно современной систематике патогенные микроорганизмы относятся к царству прокариот, патогенные простейшие и грибы – к царству эукариот, вирусы объединяются в отдельное царство – Vira.Все прокариоты, имеющие единый тип организации клеток, объединены в один отдел – Bacteria. Однако отдельные их группы отличаются структурными и физиологическими особенностями. На этом основании выделяют:
1) собственно бактерии;2) актиномицеты;3) спирохеты;4) риккетсии;5) хламидии;6) микоплазмы.
2. Модификационный метод. Модификационный метод с применением субстрата казеина основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических ферментов, содержащихся в материале, взятом на анализ. Скорость реакции определяют по количеству образовавшихся аминокислот - тирозина (-амино--оксифенилпропионовая кислота) и триптофана (-амино--индолилпропионовая кислота), которые устанавливают колориметрической реакцией с реактивом Фолина. Этим методом определяют указанные аминокислоты как в свободном, так и в связанном состоянии.По количеству тирозина и триптофана, содержащемуся в гидролизате, определяют количество превращенного белка в процессе ферментативной реакции (из расчета содержания в белке 6% тирозина и 1.8% триптофана). В основу расчета активности протеолитических ферментов положена зависимость степени гидролиза белка от числа единиц активности фермента, введенных в ферментативную реакцию. На основе этой зависимости составляется график.Поскольку в данном методе количество аминокислот, характеризующих количество превращаемого белка, определяется по интенсивности окраски реакционных сред - оптической плотности после реакции с реактивом, то в графике для простоты расчета вместо количества превращенного белка ставится пропорциональная ему оптическая плотность раствора. При составлении графика по оси абсцисс откладывают число единиц фермента, введенное в ферментативную реакцию, а по оси ординат - оптическую плотность, полученную после колориметрической реакции с реактивом Фолина.
Определение пепсина по Ансону и Мирскому. Данный метод основан на следующих принципах. Гемоглобин подвергают воздействию пепсина, оставшийся гемоглобин осаждают трихлоруксусной кислотой. Фенольные свойства остатка (тирозин), определяемые фотометрически, используют как меру активности фермента.
3. Химический состав фагов
Изучение химического состава фагов стало возможно лишь тогда, когда были усовершенствованы методы получения в больших количествах очищенных препаратов фага. В настоящее время изучен химический состав фагов, принадлежащих к разным морфологическим типам и поражающих микроорганизмы почти всех систематических групп. Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты — дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую (РНК). Этим свойством вирусы отличаются от микроорганизмов, содержащих в клетках оба типа нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%).
Таким образом, по химическому составу фаги являются нуклеопротеидами. В зависимости от типа своей нуклеиновой кислоты фаги делятся на ДНК-овые и РНК-овые. Количество белка и нуклеиновой кислоты у разных фагов разное. У некоторых фагов содержание их почти одинаковое и каждый из этих компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно.
Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и некоторые преимущественно нейтральные жиры. Все известные фаги второго морфологического типа РНК-овые. Среди фагов третьего морфологического типа встречаются как РНК-овые, так и ДНК-овые формы. Фаги остальных морфологических типов — ДНК-овые.
Билет №13
№1Морфология вирусов. Размеры вирусов.
Несмотря на внутриклеточный паразитизм, среди вирусов имеются крупные виды, соизмеримые по размерам с микоплазмами и хламидиями. Например, вирус натуральной оспы достигает 400 нм и вполне сравним с риккетсиями (300-500 нм) и хламидиями (300-400 нм). По морфологии выделяют вирусы палочковидные (например, возбудитель лихорадки Эбола), пуле-видные (вирус бешенства), сферические (герпесвирусы), овальные (вирус оспы), а также бактериофаги, имеющие сложную форму (рис. 2-1). При всём разнообразии конфигураций, размеров и функциональных характеристик вирусам присущи некоторые общие признаки. В общем виде зрелая вирусная частица (вирион) состоит из нуклеиновой кислоты, белков и липидов, либо в его состав входят только нуклеиновые кислоты и белки.
Таксономия вирусов в основных чертах похожа на таксономию клеточных организмов. Таксономические категории , используемые в классификации вирусов, такие):
Ряд ( -virales )
Семья ( -viridae )
Подсемейство ( -virinae )
Род ( -virus )
Вид
Классификация
1.Вирусы с оболочкой -ДНК двунитевые (Herpesviridae , Poxviridae)
-РНК однотитевые (filoviridae , retroviridae )2.Вирусы с оболочкой -ДНК двунитиевые (adenoviridae)
-ДНК однонитевые (parvoviridae); -РНК двунитевые (reiviridae)
-РНК однонитевые (picornaviridae)
№2
1.Элективные, или избирательные, и обогатительные среды. В таких средах созданы благоприятные условия для развития какого-нибудь одного вида микроорганизма,размножение всех остальных видов микробов угнетается. Для этого к среде добавляют либо питательные вещества, которые может использовать только изучаемый микроб, либо различные факторы угнетения, к которым этот микроб нечувствителен. Этот тип питательных сред используется для выделения и установления природы микроорганизмов, присутствующих в исследуемом материале в очень небольшом количестве по сравнению с другими формами. Примерами избирательных сред являются среды, содержащие желчь или соли желчных кислот и бриллиантовую зелень, а также среды, содержащие селенит, которые применяются для выделения патогенных кишечных бактерий. На этих средах подавляется росткишечной палочки. Для первичных посевов возбудителей дифтерии используют свернутую лошадиную сыворотку, на которой все другие виды микробов растут значительно медленнее. 2. Дифференциально-диагностические среды. Эти питательные среды применяются для идентификации бактериальных культур. Использование дифференциально-диагностических питательных сред основано на том, что при росте на них бактерий происходят химические изменения компонентов среды, которые легко можно наблюдать. В качестве изменяющегося компонента дифференциально-диагностических питательных сред чаще всего применяются различные белковые вещества, сахара и многоатомные спирты, в результате расщепления которых микробами изменяется реакция среды, что учитывается по изменению окраски добавленных к среде индикаторов, появлению пузырьков газа и т. п. Примерами широко используемых дифференциально-диагностических питательных сред могут служить среды так называемого В некоторых случаях при культивировании микроорганизмов необходимо создать условия, максимально приближающиеся к условиям их естественного обитания. Для этого используют так называемые натуральные среды. В качестве основного компонента многих питательных сред используют естественные биологические субстраты в неизмененном виде, например кровь, молоко, желчь и т. ппестрого ряда, применяемые для выяснения способности микробов сбраживать различные сахара (среды Гисса и др.).
№3Лизогенизация
превращение
нелизогенных клеток бактерий в лизогепные
при заражении их так называемыми
умеренными бактериофагами. При Л ДНК
умеренного (невирулентного) бактериофага
включается в структуру бактериальной
ДНК и остаётся в ней в скрытой
неинфекционной форме, называется Профагом.
Частота Л. — отношение числа
лизогенизированных клеток к общему
числу инфицированных клеток — зависит
от температуры, состава питательной
среды и др. причин и повышается с
понижением уровня метаболизма бактерий;
используется для характеристики
умеренных фагов. Механизм Л. окончательно
не выяснен.
Фаговая инфекция [греч. phagos — пожирающий; лат. inficere — портить, заражать] — заражение микроорганизмов фагом. Начальным процессом Ф.и. служит присоединение частицы фага к бактерии с использованием белковых рецепторов, расположенных на поверхности бактериальной клетки (липополисахариды, белки капсул, фимбрий и др.). После присоединения к клеточной поверхности фаги обычно прокалывают клеточную стенку и впрыскивают в клетку свой генетический материал (ДНК или РНК), который начинает управлять клеточными механизмами и программирует синтез нового фагового материала.
Билет №14.
1.Хим состав вирионов.Простые вирусы состоят из белка и нуклеиновый кислоты. Наиболее важная часть вирусной частицы - нуклеиновая кислота – яв-ся носителем генетической информации. Если клетки человека, животных, растений и бактерий всегда содержат два типа нуклеиновых кислот ДНК и РНК, то у разных вирусов обнаружен лишь один тип - или ДНК, или РНК. Второй обязательный компонент вириона - белки отличаются у разных вирусов, что позволяет распознавать их с помощью иммунологических реакций. Более сложные по структуре вирусы, кроме белков и нуклеиновых кис лот, содержат углеводы, липиды. Для каждой группы вирусов характерен свой набор белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Каждый компонент вирионов имеет определённые функции: белковая оболочка защищает их от неблагоприятных воздействий, нуклеиновая кислота отвечает за наследственные и инфекционные свойства и играет ведущую роль в изменчивости вирусов, а ферменты участвуют в их размножении. Обычно нуклеиновая кислота находится в центре вириона и окружена белковой оболочкой (капсидом), как бы одета в неё. Капсид состоит изопределённым образом уложенных однотипных белковыхмолекул (капсомеров), которые образуют симметричные геометрические формы в месте с нуклеиновой кислотой вирусы (нуклеокапсид).
2. Рост и размножение бактерий.Термин «рост» означает увеличение цитоплазматической массы отдельной клетки или группы бактерий в результате синтеза клеточного материала (например, белка, РНК,ДНК). Достигнув определенных размеров, клетка прекращает рост и начинает размножаться.Под размножением микробов подра;зумевают способность их к самовоспроизведению, увеличению количества особей на единицу объема. Иначе можно сказать: размножение — это повышение числа особей микробной популяции.Репликация ДНК и деление клеток происходит с определенной скоростью, присущей каждому виду микроба, что зависит от возраста культуры и характера питательной среды.Типы деления клеток бактерий. 1. Клеточное деление опережает разделение, что приводит к образованию «многоклеточных» палочек и кокков. 2. Синхронное клеточное деление, при котором разделение и деление нуклеоида сопровождаются образованием одноклеточных организмов. 3. Деление нуклеоида опережает клеточное деление, обусловливая образование многонуклеоидных бактерий.
3.Техника посева и пересева бактреий.Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля.Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри—металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой вынимают из нее ватную пробку над пламенем горелки, набирают петлей посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).При работе с пипеткой прежде всего ее освобождают от бумаги или вынимают из пенала, быстрым движением проводят над пламенем горелки, вводят в пробирку и остужают об ее внутреннюю сторону. Затем всасывают посевной материал ртом и, соблюдая описанные выше правила, выдувают его в пробирку или другую лабораторную посуду.' Микробную культуру безопаснее всасывать через резиновую трубку или с помощью резиновой груши. Отработанную пипетку опускают в банку с дезинфицирующим раствором. Таким же образом производят посевы пастеровскими пипетками, предварительно обламывая запаянный конец.