Лабораторное занятие 4

Задание: определить бактериальную обсеменённость молока.

Приборы и реактивы: стерильные пробирки, пробы молока, редуктазник, рабочий раствор метиленовой сини, 0,005% раствор резазурина, резиновые пробки.

1. Проба на редуктазу с метиленовой синью. ГОСТ 9225-84

Сущность метода основана на определении биохимической активности микробов, продуцирующих фермент редуктазу. Редуктаза обладает способностью обесцвечивать некоторые краски, в частности метиленовую синь. Однако не все микроорганизмы обладают восстановительной активностью. В большей степени этим свойством обладают молочнокислые стрептококки, кишечная палочка, масляно-кислые и гнилостные бактерии. Несколько меньше – сальмонеллы и стафилококки, а патогенные стрептококки лишены этой способности.

Приготовление основного спиртового раствора метиленовой сини.

10 г метиленовой сини залить 100 cм³ спирта и оставить в термостате на сутки при 37°С. Профильтровать. Стандартный рабочий раствор готовят из основного: к 5 cм³ этого раствора прибавить 195 cм³ дистиллированной воды.

Техника определения:

1. В чистую пробирку налить 1 cм³ рабочего раствора метиленовой сини и 20 cм³ исследуемого молока, закрыть пробкой и хорошо перемешать.

2. Пробирку с молоком поместить в редуктазник с температурой воды 38-40°С уровень воды в редуктазнике должен быть выше уровня молока в пробирке, необходимо постоянно поддерживать температуру воды

3. Проверять время обесцвечивания проб через 40 минут, 2,5 часа и через 3,5 часа. Окончанием испытания на редуктазу считать момент, когда молоко в пробирках обесцветиться. Наличие небольшого окрашенного кольцеобразного слоя наверху или окраска небольшой части внизу в расчёт не принимаются.

Молоко по количеству микрофлоры делят на 4 класса.

Таблица 10.

Определение класса бактериальной загрязнённости молока

(с метиленовой синью)

Скорость обесцвечивания	Количество бактерий в 1 мл молока, КОЕ	Класс молока
40 минут 2,5 часа до 3,5 часов более 3,5 часов	4 млн. до 20 млн. 500 тыс-4 млн. от 300 до 500 тыс. До 300 тыс.	3 2 1 высший

2. Проба на редуктазу с резазурином.

Готовят основной раствор резазурина: 10 мг резазурина растворяют в 200 cм³ дистиллированной воды и хранят в холодильнике до 30 суток при температуре 3-5⁰С. Рабочий раствор готовят, разбавляя основной раствор дистиллированной водой в соотношении 1:10, он содержит 0,005% резазурина.

Техника определения: В чистую пробирку отмеривают 10 cм³ молока, добавляют 1 cм³ 0,005%-ного рабочего раствора резазурина. Пробирку закрывают пробкой, осторожно перемешивают содержимое, ставят на водяную баню при температуре 37°С±1°С и в течение 1 и 1,5 часа наблюдают за изменением окраски. Интенсивность окраски содержимого пробирки определяют путём сравнения с данными таблицы №11.

Таблица 11.

Количество бактерий в молоке и его класс по редуктазной пробе с

резазурином

Класс молока	Скорость обесцвечивания, Час.	Цвет молока	Количество бактерий в 1 cм3 молока.
Высший 1 2 3	1,5 1 1 1	Серо-сиреневый до сиреневого со слабым сероватым оттенком. Серо-сиреневый до сиреневого со слабым сероватым оттенком. Сиреневый с розовым оттенком или ярко розовый. Бледно-розовый или белый.	До 300 тыс. От 300 тыс. до 500тыс. От 500 тыс. до 4 млн. от 4 млн. до 20 млн.

Факторы, влияющие на точность определения:

1. Неправильно приготовленный раствор метиленовой сини или резазурина

2. Низкая температура в водяной бане

3. Грязные пробирки

4. Неплотно закрытые пробирки

Выполнить самостоятельно:

1. Определить бактериальную обсеменённость молока с метиленовой синью и резазурином

Пробы	Время обесцвечивания	Количество микрофлоры	Санитарная оценка молока
1. 2.