3.14. Исходные субстраты синтеза пуриновых нуклеотидов: а) доноры азота – АК (глу, асп, гли) б) доноры углерода – CO2, формил-, метинил- (их переносчик ТГФК – активная форма вит. В9).
Регуляция синтеза направлена на амидотрансферазу:
1) избыток пуриновых нуклеотидов ингибирует ключевой фермент, избыток пиримидиновых нуклеотидов активирует ключевой фермент.
2) избыток АТФ ингибирует образование аденилоянтарной кислоты, избыток ГТФ – ксантила.
3) перекрестная регуляция: для синтеза АМФ нужна энергия ГТФ и наоборот.
Роль витамина в процессе синтеза: В9 – переносчик доноров углерода, В1 – в составе НАД+.
3.15. Источники пентоз для синтеза пиримидиновых нуклеотидов: СО2, аспартат, глутамин.
Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов:
Регуляция синтеза: ключевой фермент – цитоплазматическая КФС II.
1. Избыток пиримидиновых ингибирует, а пуриновых – активирует синтез.
2. УТФ тормозит активность ключевого фермента, конкурируя с ATФ
3. ФРПФ является активатором ключевого фермента
4. OMФ декарбоксилаза ингибируется УМФ и ЦМФ (при нормальных условиях имеет ограниченное значение).
Оротовая кислота (витамин В13) – витаминоподобное вещество, участвующее в метаболизме фолиевой кислоты и витамина В12. Биологические активная форма – оротидин-5-фосфат – необходима для синтеза пиримидиновых нуклеотидов. Стимулирует синтез белка, тормозит атеросклеротические процессы. Оротовой кислотой особенно богаты кисломолочные продукты.
Роль витаминов в биосинтезе оснований: В9 – в составе декарбоксилаз, В1 – в составе НАД+, В13.
3.16. Матричный синтез ДНК – репликация – удвоение ДНК. Происходит в S-фазу клеточного цикла. Полуконсервативный процесс.
Ферменты синтеза (более 40, образуют комплекс - реплисому):
1. ДНК-полимераза – главный фермент – ведет синтез дочерней цепи по принципу комплементарности, антипараллельности и в одном направлении (5’3’).
2. хеликаза - раскручивает двойную спираль
3. топоизомераза - снимает напряжение в области репликативной вилки и предотвращает обратное скручивание
4. ДНК-лигаза - сшивает отдельные фрагменты Оказаки
5. праймаза – катализирует синтез праймеров (разновидность РНК-полимеразы)
Субстраты для ДНК-полимеразы: нуклеозид-3-фосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ), также требует кроме субстратов, ионы магния и праймер (затравочный олигонуклеотид).
Механизм репликации:
Репликация начинается в точке «ori» (в этой точке много пар нуклеотидов А-Т) образуется репликационный пузырь (раскрученный участок молекулы ДНК) образуются репликационные вилки в углах пузыря в вилку встраивается: 1) хеликаза – раскручивает двойную спираль, разрывая водородные связи между нуклеотидами 2) топоизомераза – снимает напряжение в репликационной вилке и предотвращает обратное скручивание 3) праймаза – ДНК-зависимая РНК-полимераза – синтезирует праймер ДНК-полимераза II синтезирует дочернюю цепь на лидирующей (3’-5’) непрерывно, а на отстающей (5’3’) – фрагментами Оказаки за счет праймеров ДНК-полимераза I удаляет праймеры из одной цепи ДНК, присоединяясь к концу фрагмента Оказаки и идя в сторону 3’5’ отщепляет по одному РНК-нуклеотиду, замещая их на нуклеотиды ДНК фрагменты Оказаки сшиваются ДНК-лигазой.
Особенности синтеза у эукариот и прокариот:
1. В отличие от прокариот, которые делятся постоянно, синтез ДНК у эукариот тесно связан с клеточным циклом
2. Эукариоты отличаются от прокариот и по набору ДНК полимераз ( - обладает праймазной активностью, - репаративная, - митохондриальная ДНКполимераза, - основная полимераза лидирующей цепи, - функция этой полимеразы еще не полностью изучена.)
3.17. ПЦР – способ увеличения количества копий ДНК, находящейся в биологическом материале в минимальных количествах.
Этапы:
1) денатурация ДНК (до 90)
2) добавление специфического праймера и охлаждение ДНК (до 55) (отжиг)
3) добавление нуклеотидов (субстратов синтеза) и ДНК-полимеразы (фермента синтеза)
4) повторение цикла.
Позволяет за короткое время получить множество копий ДНК (порядка 20 млн за 0,5 ч).
Применение:
1) диагностика вирусных и бактериальных инфекций (ВИЧ, гепатит, хламидиоз, туберкулеза, менингита)
2) генетическая диагностика заболеваний
3) судебная медицина.
4) изучение генома человека
Клонирование – получение большого количества молекул, клеток, организмов – потомков одного предка, отдельных генов.
Вектор – природный ген определенного микроорганизма с внедренным в него участком чужеродного гена.
Рестриктазы (рестриктационные эндонуклеазы) – ферменты, узнающие специфическую последовательность нуклеотидов и разрывающие в этом месте молекулу ДНК. Действуют в области палиндромов ДНК – мест, где последовательность нуклеотидов одной цепи идентична последовательности нуклеотидов другой цепи, прочитанной в обратном порядке. В молекулярной биологии рестриктазы используют для создания генетических векторов (внедрение гена в плазмиду и т.п.).
В качестве векторов применяется: 1) плазмида – небольшая кольцевидная молекула ДНК бактерий, реплицируемая независимо от нуклеоида 2) бактериофаг лямбда 3) хромосомы дрожжей 4) космидные векторы - гибрид фага лямбда и плазмиды.
Этапы клонирования:
1) получение генетического материала (разрезание рестриктазами вектора и внедряемого гена с образованием палиндромов)
2) включение гена в векторную молекулу с помощью лигаз и создание рекомбинантной ДНК
3) введение рекДНК в кл хозяина
4) отбор трансформированных кл на селективных средах.
Применение:
1) получение разнообразных вакцин и иммунологических диагностикумов
2) синтез ряда БАВ: СТГ, инсулин, эритропоэтин, интерфероны, факторы свертывания крови
3) получение ферментов в промышленности
4) получение относительно недорогого пищевого белка для животных и т.д.
3.18 Транскрипция – биосинтез иРНК на матрице ДНК. Процесс консервативный.