3. Ферментативный гидролиз сахарозы

Сахароза представляет собой дисахарид С₁₂Н₂₂О₁₁. Это нередуцирующее вещество, не реагирующее с фелинговой жидкостью. Сахароза гидролизуется под действием фермента - сахаразы (инвертазы). Реакция идет с присоединением воды и образованием молекул глюкозы и фруктозы, которые являются редуцирующими сахарами и могут быть обнаружены реакцией с фелинговой жидкостью.

С₁₂Н₂₂О₁₁ + Н₂О = С₆Н₁₂О₆ + С₆Н₁₂О₆

сахароза глюкоза фруктоза

Наиболее активную сахарозу содержат клетки дрожжей, из которых ее легко получить. Активность сахарозы можно легко контролировать по количеству продуктов гидролиза, образующихся за определенной время, которые обнаруживаются с помощью фелинговой жидкости. Определение ведут по количеству гидролизованного раствора, которое нужно прилить к фелинговой жидкости, чтобы выпал осадок закиси меди.

Скорость гидролиза сахарозы зависит от внешних условий (температура, катализатор, реакция среды).

Оборудование:

штатив

пробирки

карандаш по стеклу

мерная пипетка на 1-2 мл

пипетки

мерный цилиндр на 10 мл

баня водяная

термометр лабораторные на интервал температур 50 – 100 °С

часы песочные на 10 мин или любые другие часы.

Ход работы:

Подготовить таблицу 5 для записи схемы опыта и результатов опыта. Подготовить и подписать три пробирки, налить в них по 10 мл 20% раствора сахарозы.

В пробирки с сахарозой налить необходимое количество воды, 0,1 н раствора HCl или 0,1 н раствора NaOH.

Внести в опытные пробирки нужное количество фермента или неорганического катализатора (соляной кислоты), тщательно перемешать и поставить пробирки на 40-50 мин.

Приготовить три пробирки с раствором фелинговой жидкости (ФЖ): в каждую из трех пробирок влить по 2 мл ФЖ и дистиллированной воды. По истечении времени определить активность сахаразы или неорганического катализатора следующим образом: в три пробирки с нагретым до кипения раствором ФЖ поочередно прилить по каплям жидкость из опытных растворов до полного покраснения раствора ФЖ. Количество капель опытного раствора занести в таблицу 5.

Сравнить результаты по отдельным вариантам опыта и сделать выводы о влиянии изучаемых условий на скорость гидролиза сахарозы.

Таблица 5.- Влияние различных условий на скорость реакции

№ п/п	Вариант	№ про бир ки*	К 10 мл сахарозы вносят, мл				катализатор	Условия опыта (t°С, pH)	Кол-во капель испытуемого раствора, пошедшее на реакцию с ФЖ
			вода	0,1 н. HCl		0,1 н. NaOH
1	Влияние температуры	1	4				фермент 1 мл	18-20°С
		2	4				фермент 1 мл	40-45°С
		3	4				фермент 1 мл	100°С
2	Влияние температуры на неорганический катализатор	1	5				HCl 2 капли	18-20°С
		2	5				HCl 2 капли	40-45°С
		3	5				HCl 2 капли	100°С
3	Влияние pH среды	1		4			фермент 1 мл	40-45°С (pH 4,5)
		2	4				фермент 1 мл	40-45°С (pH 6,5)
		3			4		фермент 1 мл	40-45°С (pH 7,5)
4	Влияние количества фермента	1	4				фермент 1 мл	40-45°С
		2	3				фермент 2мл	40-45°С
		3	1				фермент 4 мл	40-45°С

Контрольные вопросы:

1. Как можно обнаружить присутствие редуцирующих сахаров?

2. Что такое ферментативный гидролиз?

3. Какие условия будут оказывать влияние на скорость гидролиза?

4. Количественное определение восстанавливающих сахаров. Ускоренный метод определения массовой доли общего сахара

Метод основан на окислении всех сахаров сернокислым раствором двухромовокислого калия до углекислоты и воды и колориметрировании образовавшегося иона Сг⁺³, эквивалентного количеству вступившего в реакцию сахара.

Оборудование:

баня водяная

бумага фильтровальная лабораторная

весы лабораторные общего назначения

колбы мерные

пестики

пипетки

стаканы

ступка

фотоэлектроколориметр

цилиндр

часы

эксикатор

Ход работы:

Приготовление сернокислого раствора двухромовокислого калия

49 г двухромовокислого калия растворяют в 300 см³ дистиллированной воды (первый раствор). Отдельно к 300 см³ дистиллированной воды осторожно небольшими порциями при перемешивании приливают 300 см³ концентрированной серной кислоты и охлаждают (второй раствор). Сначала первый, а затем второй раствор осторожно переливают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают.

Построение калибровочного графика производят не ранее чем через сутки после приготовления реактива.

Приготовление стандартного раствора сахарозы

1,0 г сахарозы или сахара-рафинада, предварительно высушенных в эксикаторе в течение 3-х суток, взвешивают с погрешностью не более 0,001 г, растворяют в дистиллированной воде и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³ . Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Полученный раствор должен содержать 4 мг сахарозы в 1 см³. Раствор сахарозы готовят непосредственно перед употреблением.

Построение калибровочного графика

В пять мерных колб вместимостью каждая 100 см³ мерным цилиндром вносят по 25 см³ сернокислого раствора двухромовокислого калия, затем пипеткой 2, 4, 6, 8, 10 см³ стандартного раствора сахарозы и по 23, 21, 19, 17, 15 см дистиллированной воды, чтобы объем в каждой колбе достиг 50 см³. Колбы с содержимым помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре со светофильтром, имеющим максимум светопропускания при λ = 630-670 мкм (на ФЭК-56 и КФК-2 этому соответствуют красный светофильтр и кювета 30 мм).

Оптическую плотность измеряют в каждом растворе не менее 3 раз и из полученных данных берут среднеарифметическое значение.

По полученным данным строят калибровочный график, откладывая на оси ординат значения оптической плотности, а на оси абсцисс - соответствующие этим значениям массы сахарозы в миллиграммах. Калибровочный график используется для определения общего сахара.

Анализ результатов:

Навеску измельченного исследуемого изделия взвешивают с погрешностью не более 0,001 г из такого расчета, чтобы в 1 см³ раствора было 0,004 г общего сахара.

Массу навески (т) в граммах определяют по формуле:

m= 0.004V/P *100 ,

где 0,004 - оптимальная концентрация редуцирующих веществ раствора навески, г/см³;

V- вместимость мерной колбы, см³;

Р - предполагаемая массовая доля общего сахара в исследуемом изделии, %.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ мерным цилиндром вносят 25 см³ сернокислого раствора двухромовокислого калия, 10 см³ фильтрата исследуемого раствора и 15 см³ дистиллированной воды. Колбу помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность. По значению оптической плотности и калибровочному графику находят соответствующее количество общего сахара, условно выраженное в сахарозе.

Массовую долю общего сахара ( X₁) в процентах, выраженную в сахарозе, определяют по формуле

X₁=m₁VK100/mV₁1000,

где m- масса навески изделия, г;

m₁- масса сахарозы, полученная по калибровочному графику, мг;

V - вместимость мерной колбы, см ;

V₁ - объем исследуемого раствора, взятый для анализа, см ;

1000 - коэффициент пересчета миллиграммов сахарозы в граммы;

К - поправочный коэффициент, учитывающий окисление декстринов (для изделий, содержащих патоку), определяют по табл.6.

Таблица 6.-Поправочный коэффициент, учитывающий окисление декстринов

Отношение содержания патоки к содержанию общего сахара. %	Поправочный коэффициент К
2-5 6-10 11-15 16-20 21-30	0.96 0.94 0.92 0.90 0.88

Массовую долю общего сахара (X₂) в процентах в пересчете на сухое вещество определяют по формуле

X₂=X₁100/100-W,

где W- массовая доля влаги в исследуемом изделии, %.

За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми в одной лаборатории не должны превышать по абсолютному значению 0,5%, а выполненных в разных лабораториях -1,0%.

Пределы допускаемых значений погрешности измерения ±1,0% при доверительной вероятности Р =0.95.

Результат вычислений округляют до первого десятичного знака.