Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України
Львівський національний університет імені Івана Франка
Біологічний факультет
Кафедра мікробіології
Науковий семінар на тему:
Асиміляція Fe (ІІІ) прокаріотами
Підготувла:
Студентка групи БЛБ-52с
Петришин О.
Викладач:
доц. Перетятко Т.Б.
Львів–2013
Вступ
Залізо є життєво важливим елементом для всіх аеробних організмів. Воно зв’язане з багатьма білками і ферментами, які каталізують реакції окислення і відновлення в клітині. Добре відома потреба в залізі для дихання, фотосинтезу, фіксації азоту, утворення дезоксирибонуклеотидів. Крім цього, залізо виконує низку регуляторних функцій у метаболізмі, зокрема бере участь у регуляції синтезу оксидоредуктаз, гему, форміатдегідрогенази, бактерійних протеїназ, дифтерійного та інших токсинів, ферментів метаболізму заліза та біосинтезу рибофлавіну (РФ).
У біологічному аспекті важливими є дві властивості заліза. В аеробних умовах іони двовалентного заліза швидко окислюються до Fe(III) і перетворюються у дуже слаборозчинний гідроокис заліза, що робить його недоступним для живих організмів. У високих концентраціях і Fe(II) , і Fe(III) , якщо є кисень, можуть бути токсичними для клітини внаслідок утворення високореактивних вільних радикалів. Такі властивості заліза змусили організми виробити спеціальні пристосування для забезпечення себе цим металом за наявності кисню, а також для підтримання вмісту заліза в клітині на нетоксичому рівні. Різноманітність цих пристосувань є важливим екологічним фактором, а також стосується здоров’я людини, оскільки зміни внутрішньоклітинного пулу заліза спостерігаються при багатьох захворюваннях, старінні, мікробній інфекції [27].
Асиміляція Fe(III). Загальна характеристика
Багато мікроорганізмів - бактерій і грибів - у відповідь на недостатнє забезпечення залізом виділяють низькомолекулярні сполуки - (сидерофори), які мають високу спорідненість до Fe(III). Зв’язуючи залізо, сидерофори переводять його у розчинний стан [15]. Асиміляція заліза складається з декількох етапів: зв’язування комплексу Fe(III)-сидерофор з спеціальними мембранними білками, перенесення металу в клітини, вивільнення заліза з комплексу і включення його у ферменти і резервні білки. Інший механізм асиміляції заліза полягає у його позаклітинному відновленні і поглинанні розчинного Fe(II) за участю пермеаз. Системи поглинання заліза добре вивчені у Escherichia coli та деяких інших видів бактерій, а також у декількох видів грибів (Ustilago sphaerоgena). Механізми поглинання заліза дріжджами до недавна не були з’ясовані. Останніми роками транспорт заліза у дріжджів активно досліджують у декількох лабораторіях, досягнуто значних успіхів у пізнанні того, як дріжджі розчиняють, транспортують і акумулюють залізо.
Ще 1970 р. Аткін і співавтори. [13], досліджуючи 142 штами 19 видів дріжджів, з’ясували, що більшість з них не екскретує сидерофорів у відповідь на недостатнє забезпечення залізом. Хоча сидерофори гідроксаматного типу виявлені у дріжджів, які належать до родів Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces. Sporobolus. В умовах дефіциту заліза дріжджі Rhodotorula pilimanae утворюють до 10 мг/л родоторулевої кислоти.
Комлекс Fe(III)-родоторулева кислота не проникає в клітину, а тільки забезпечує розчинення і зв’язування металу з мембранними білками-переносниками. Такий механізм поглинання заліза називають залізо-таксі [25].
У дріжджів Pichia guilliermondii виявили речовини пептидної природи з Мr= 1000-1200 Да, здатні зв’язувати іони Fe(III) і забезпечувати його поглинання дріжджовою клітиною [3]. В умовах дефіциту заліза [23] дріжджі Saccharomyces cerevisiae виділяють у середовище флюоресцентні фенольні сполуки (антранілат і гідроксиантранілат), які можуть сприяти транспорту заліза в клітини, стабілізуючи його в середовищі вирощування і підтримуючи у відновленому стані. Певну роль у забезпеченні дріжджів залізом можуть відігравати інтермедіати циклу Кребса - лимонна, молочна, янтарна кислоти -, які теж можуть зв’язувати залізо [26]. Засвоєння заліза з комплексів із цитратом, малатом, сукцинатом і оксалоацетатом досліджено у P. guilliermondii [2]. Виявлено, що поглинання заліза з комплексу з цитратом є активним транспортним процесом. Здатність до поглинання Fe(III) за участю цитрату ми виявили також у дріжджів Candida boidinii, S. cerevisiae, Debaryomyces kloeckeri, Candida utilis, Hansenula polymorpha. Цитратозалежна система транспорту заліза може брати участь не тільки в розчиненні цього металу в середовищі і транспорті його в клітини, а й у розчиненні полімерної плівки гідроокису заліза, яка утворюються за наявності в середовищі комплексів заліза з малатом, сукцинатом та іншими сполуками.
Незважаючи на відсутність власних сидерофорів, дріжджі здатні використовувати залізо з комплексів із сидерофорами, синтезованими іншими мікроорганізмами. Можливість поглинання заліза з комплексів з десфериоксаміном В, копрогеном, родоторулевою кислотою, а також з ЕДТА описана для P. guilliermondii [10]. Найвища швидкість поглинання 55Fe спостерігалась, коли використовувалі фериоксамін В і родоторулеву кислоту. Найактивніше поглинали 55Fe клітини з логарифмічної фази росту. Клітини, вирощені в середовищі з низьким вмістом заліза (0,01 мг/л), поглинали 55Fe з усіх досліджених комплексів з значно вищою швидкістю, ніж залізовмісні клітини.
Отже, P. guilliermondii може забезпечувати себе залізом, використовуючи сидерофоро- або цитратозалежну систему транспорту цього металу. S. cerevisiae теж може використовувати залізо з фериоксаміну В, ферикроцину і комплексу з родоторулевою кислотою.[22]. Здатність дріжджів асимілювати залізо з комплексів із сидерофорами, синтезованими іншими мікроорганізмами, можливо, забезпечує їм виживання в природних умовах.
Асиміляція заліза з комплексів з хелатами потребує внутрішньоклітинної або позаклітинної дисоціації комплексу. Іони двовалентного заліза мають значно нижчу спорідненість до сидерофорів, тому при відновленні залізо звільняється з комплексу. Ферисидерофорредуктазні активності описані у багатьох мікроорганізмів [19]. Здатність до позаклітинного відновлення заліза, хелатованого сидерофорами, досліджена у S. cerevisiae [19], а також у P. guilliermondii, Pichia pinus. C. boidinii, D. kloeckeri, Candida famata, H. polymorpha, Candida crusei. Найвищу фериредуктазну активність клітин P. guilliermondii простежували, коли використовували як субстрат Fe(III)-родоторулеву кислоту. Досліджено властивості частково очищеної цитозольної фериредуктази P. guilliermondii. Виявлено, що донорами електронів можуть бути NADH і NADPH , іони Сu(II) і Mg(II) стимулюють відновлення Fe(III) до Fe(II).
Для вираження зовнішньомембранної фериредуктазної активності S. cerevisiae необхідна експресія двох генів - FREI і FREII -, яка лімітує асиміляцію Fe(II). Денціс і співавтори. [18] дослідили, що мутація в гені FREI приводить до різкого зниження (на 90-95%) фериредуктазної активності. Фериредуктаза S. cerevisiae є NADP-залежним білком, частково очищені препарати з плазматичних мембран здатні каталізуввати перенесення електронів з NADPH на різноманітні Fe(III)-комплекси та акцептори електронів (фериціанід, дихлорфеноліндофенол). Для максимальної активності фермент потребує FMN.
Фериредуктазна активність S. cerevisiae зростає у декілька разів у випадку недостатнього забезпечення клітин залізом. Регуляція залізом здійснюється через активатор транскрипції, який індукується в умовах дефіциту заліза [18]. В контролі фериредуктазної активності беруть участь також cAMP і гем. Для високоспорідненого транспорту Fe(II) в дріжджову клітину необхідним є поглинання міді. Для асиміляції заліза S. cerevisiae важливими є два гени: CTRI , що кодує білок, потрібний для поглинання міді, і FET3, який кодує Сu-залежну оксидазу [14]. Механізм зв’язку між цією оксидазою і транспортом заліза залишається нез”ясованим, не ідентифіковані і структурні компоненти Fe(II)-транспортера. Однак доведено, що транспорт Fe(II) регулюється наявністю заліза. Активатор транспорту Fe(II) - продукт гена AFTI - активує і фериредуктазу, і FET3, і Fe(II)-транспорт у відповідь на дефіцит заліза шляхом контролю транскрипції. Другим геном, який бере участь у відновній асиміляції заліза у S. cerevisiae, є MACI, продукт якого , можливо, взаємодіє з міддю і регулює експресію FRE-генів [20].
Фериредуктазна активність P. guilliermondii, D. kloeckeri, C. famata, C. boidinii теж залежить від вмісту заліза в середовищі вирощування [4]. Здатність відновлювати Fe(III) до Fe(II) залежить від природи комплексу Fe(III)-сидерофор і є максимальною у логарифмічній фазі росту. Проте фериредуктазна активність C. crusei, H. рolymorpha і P. pinus не змінюється зі зменшенням вмісту заліза в середовищі вирощування. Активність фериредуктази S.cerevisiae і P.guilliermondii зростає при наявності іонів міді. Внесення Cu(II) у концентрації 2х10-4М в інкубаційне середовище стимулює відновлення Fe-цитрату залізодефіцитними клітинами P.guilliermondii у чотири , а залізовмісними - у два рази [5].
У P.guilliermondii селекціоновані мутанти, позначені hit (high iron transport), які з високою швидкістю поглинають 55Fe, мають підвищений у 3-4 рази вміст заліза в клітинах, високу фериредуктазну активність і синтезують на порядок більше РФ, аніж батьківський штам [1,5]. Про зв’язок між метаболізмом заліза і здатністю деяких видів дріжджів до утворення значних кількостей РФ відомо давно, але фізіологічна роль цього явища до цього часу не з’ясована. В умовах дефіциту заліза дріжджі P. guillіermondii мають високу флавіногенну активність і високу швидкість поглинання заліза. Мутанти з пошкодженою регуляцією біосинтезу РФ - rib80 і rib81 - не тільки здатні до надсинтезу РФ, а й, подібно до hit-мутантів, з високою швидкістю поглинають 55Fe, мають підвищену фериредуктазну активність. Але тільки в клітинах мутантів rib80 знайдено підвищений у декілька разів вміст заліза [9,11,12]. Суміщення мутацій rib80 і rib81 в одному гаплоїдому геномі приводить не тільки до значного зростання флавіногенної активності дріжджів P. guilliermondii, а й до десятикратного підвищення швидкості поглинання 55Fe [8]. Провівши комплементаційний та сегрегаційний аналіз мутантів rib80, rib81 і hit, ми виявили, що описаний фенотип спричинений пошкодженням трьох різних генів. Отже, у P. guilliermondii продукти трьох генів негативного типу дії - RIB80, RIB81 і HIT - беруть участь у регуляції двох процесів: транспорту заліза і флавіногенезу. Спільні механізми контролю постачання клітин залізом і флавінами можуть бути важливими для функціонування дихального ланцюга дріж-джів. Координована регуляція біосинтезу РФ і транспорту заліза функціонує і в D. kloeckeri [6]. Флавіногенні штами D.kloeckeri , отримані шляхом селекції з використанням мутантів з неповним блоком гена RIB2 , так само, як і мутанти P. guilliermondii , селекціоновані таким же способом, крім здатності до надсинтезу РФ, характеризувались підвищеною швидкістю транспорту 55Fe і вищим вмістом заліза в клітинах.
Раніше було висловлено припущення [7], що біосинтез РФ контролюється репресором - гетероолігомерним білком, який складається з продуктів генів RIB80 і RIB81. Очевидно, що цей репресор регулює один з етапів транспорту іонів заліза, який лімітує швидкість цього процесу. Можливо, що мішенню дії репресора є фериредуктаза. Клітини мутантів rib80, rib81 і hit відновлюють Fe(III) у Fe(II) у комплексах з різними сидерофорами, цитратом і ЕДТА з високою швидкістю [4]. Яким є механізм дії продуктів генів, що контролюють біосинтез РФ, на процес відновлення заліза - невідомо.