Глава 308

ции. Несмотря на то что высокая чувствительность ПЦР часто служит причиной ложноположительных результатов, в настоящее время эти методы признаны эталонными для диагностики ВИЧ-инфекции, особенно у новорожденных из группы риска. Существует два основных метода, позво­ляющие выявить соответственно провирусную ДНК и ви­русную РНК. Первый метод заключается в следующем: 1) из предварительно лизированных лимфоцитов и моноцитов крови выделяют ДНК; 2) с помощью специально подобран­ных праймеров амплифицируют (синтезируют множество копий) консервативный участокпровируснойДНК, причем чаще всего используют пары праймеров, комплементарные последовательностям длинных концевых повторов и гена gag; 3) полученные копии выявляют с помощью гибридиза-ционного анализа. Положительные и отрицательные кон-троли позволяют исключить ошибочные результаты ПЦР, обусловленные загрязнением исследуемой пробы и наруше­нием процесса амплификации ДНК. Метод позволяет обна­ружить одну провирусную ДНК на 10 000—100 000 клеток и используется для диагностики ВИЧ-инфекции (особенно в первые 1—3 мес после заражения, пока антитела к ВИЧ от­сутствуют), а также для анализа нуклеотидных последова­тельностей провирусной ДНК и выявления штаммов ВИЧ, устойчивых к антиретровирусным средствам. Второй метод заключается в следующем: 1) выделяют всю РНК, присутст­вующую в исследуемой сыворотке; 2) с помощью обратной транскриптазы получают смесь разных кДНК; 3) проводят ПЦР, добавляя к этой смеси праймеры, комплементарные участкам вирусной кДНК; 4) полученные копии выявляют с помощью гибридизационного анализа. Метод используют как для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, так и для из­мерения концентрации вирусной РНК в сыворотке (см. ни­же). Лабораторные методы, основанные на ПЦР, использу­ют при положительных (или сомнительных) результатах ИФА и сомнительных результатах иммуноблоттинга, а так­же в тех случаях, когда серологическое исследование неце­лесообразно (например, при диагностике ВИЧ-инфекции у больных с гипогаммаглобулинемией). Однако из-за высокой стоимости и большого количества ложноположительных ре­зультатов, обусловленных загрязнением исследуемых проб, эти методы применяют лишь в тех случаях, когда стандартное серологическое исследование не позволяет с уверенностью поставить или исключить диагноз ВИЧ-инфекции.

Контроль за течением ВИЧ-инфекции

Правильно оценить состояние больного можно только на основе совокупности клинических и лабораторных данных.

Благодаря выявлению четкой зависимости между клиниче­скими проявлениями ВИЧ-инфекции и числом лимфоци­тов CD4 определение этого показателя стало неотъемлемой частью обследования ВИЧ-инфицированных. Если число лимфоцитов CD4 отражает текущее состояние иммунной системы ВИЧ-инфицированных, то по концентрации ви­русной РНК в сыворотке или плазме судят о скорости про-грессирования ВИЧ-инфекции. Одновременная оценка чис­ла лимфоцитов CD4 и концентрации вирусной РНК позво­ляет с высокой точностью предсказать характер дальнейше­го течения ВИЧ-инфекции и оценить эффективность анти-ретровирусного лечения. Ценную информацию несут и дру­гие лабораторные показатели, например концентрации в сыворотке антигена р24 (см. выше), неоптерина и Р₂-микро-глобулина (см. ниже).

Выделение вируса в культуре клеток. Этот метод применяют во многих исследовательских лабораториях для анализа ге­нетических изменений ВИЧ и выявления штаммов, устой­чивых к антиретровирусным средствам. Для выделения ви­руса исследуемый биологический материал инкубируют (до 28 сут) с культурой клеток, способных поддерживать репро­дукцию ВИЧ, чаще всего — с культурой нормальных лимфо­цитов и моноцитов крови, активированных фитогемагглю-тинином. Во время инкубации периодически проверяют культуру на наличие синцития или гигантских клеток и от­бирают пробы культуральной среды для выявления антиге­на р24 или обратной транскриптазы ВИЧ. Для диагностики ВИЧ-инфекции и наблюдения за ВИЧ-инфицированными выделение ВИЧ в культуре клеток не применяют. Обычно этот метод используют для оценки эффективности лечения ВИЧ-инфекции и для индивидуального подбора антиретро-вирусных средств.

Определение числа лимфоцитов CD4. В большинстве лабо­раторий абсолютное число лимфоцитов CD4 рассчитывают, исходя из их процентного содержания (по данным проточ­ной цитофлюориметрии) и общего числа лимфоцитов (оп­ределяют на основании общего числа лейкоцитов и лейкоци­тарной формулы). При падении числа лимфоцитов CD4 ни­же 200 мкл"¹ резко возрастает риск пневмоцистной пневмо­нии, а когда это число становится ниже 100 мкл"¹, повышает­ся также риск цитомегаловирусной инфекции и инфекции, вызванной Mycobacterium avium-intracellulare (рис. 308.21). После постановки диагноза ВИЧ-инфекции число лимфо­цитов CD4 определяют каждые 6 мес, а если отмечается тен­денция к снижению этого показателя, то чаще. Антиретро-вирусное лечение обычно назначают, когда число лимфоци­тов CD4 опускается ниже 500 мкл"¹. Снижение этого пока­зателя после начала лечения говорит о необходимости пере­смотра схемы лечения (см. ниже). При числе лимфоцитов

Таблица 308.10. Методы прямого выявления ВИЧ

Метод

Принцип метода

Чувствительность

Стоимость анализа (в долларах США)

Ловушечный ИФА на антиген р24

Определение вирус­ной РНК методом ПЦР с обратной транскрипцией Определение вирус­ной РНК методом разветвленной ДНК

Модификация ИФА, позволяющая оценить концентрацию свободного и входящего в со­став иммунных комплексов антигена р24 (для диссоциации комплексов используют слабую кислоту)

Основан на амплификации кДНК, синтези­рованной на матрице вирусной РНК

Основан на гибридизации РНК вируса с ДНК-зондом, фиксированным на твердой подложке, и последующей амплификации сигнала

Результаты положительны у 50% ВИЧ-ин- 1—2 фицированных, порог чувствительности ме­тода — 15 пг/мл

Результаты положительны более чем у 98% 150 ВИЧ-инфицированных, позволяет обнару­жить 40 копий вирусной РНК в 1 мл

Результаты положительны у 90% ВИЧ-ин- 150 фицированных, позволяет обнаружить 500 копий вирусной РНК в 1 мл

CD4 ниже 200 мкл ' начинают профилактику пневмоцист- ВИЧ-инфекция и СПИД

ной пневмонии. В результате эффективного антиретрови-русного лечения повышаются (по крайней мере временно) как абсолютное число лимфоцитов CD4, так и их процент­ное содержание.

Измерение концентрации вирусной РНК. Для прямого оп­ределения ВИЧ в сыворотке чаще всего используют методы, позволяющие с высокой точностью и чувствительностью измерить концентрацию вирусной РНК. Существует два ос­новных метода: метод ПЦР с обратной транскрипцией и ме­тод разветвленной ДНК (табл. 308.10). Первый из них за­ключается в синтезе кДНК на матрице вирусной РНК и по­следующей амплификации кДНК (см. выше), второй — в гибридизации исходной РНК вируса с ДНК-зондом, фик­сированным на твердой подложке, и последующей ампли­фикации сигнала (гл. 121). Результаты измерения выражают в количестве копий РНК в 1 мл сыворотки. Метод ПЦР с об­ратной транскрипцией позволяет определить 40 копий ви­русной РНК в 1 мл сыворотки, результаты этого исследова­ния положительны более чем у 98% ВИЧ-инфицированных. Метод разветвленной ДНК менее чувствителен — с его по­мощью можно определить 500 копий вирусной РНК в 1 мл сыворотки, результаты исследования положительны более чем у 90% ВИЧ-инфицированных. Многократное измере­ние концентрации вирусной РНК позволило установить за­висимость между выраженностью виремии и прогрессиро-ванием ВИЧ-инфекции (рис. 308.22), между репродукцией ВИЧ и активацией клеток иммунной системы, а также уста­новить появление штаммов ВИЧ, устойчивых к антиретро-вирусным средствам. Изменение числа вирусов в крови мгновенно отражается на концентрации вирусной РНК, то­гда как изменения концентрации антигена р24 существенно запаздывают. Измерение концентрации вирусной РНК в сы-

33

воротке ВИЧ-инфицированных проводят каждые 6 мес, а при изменении схемы антиретровирусного лечения — еще чаще. Многие рекомендуют начинать антиретровирусное ле­чение при повышении концентрации вирусной РНК в сы­воротке более чем до 20 000 мл"¹ независимо от уровня лим­фоцитов CD4. Однако единого мнения о показаниях к нача­лу антиретровирусного лечения пока нет. Эффективное ле­чение приводит к быстрому снижению концентрации ви­русной РНК в сыворотке.

Концентрация р₂-микроглобулина. Белок Р₂-микроглобулин (молекулярная масса 11000) находится на поверхности боль­шинства ядросодержащих клеток, где он образует гетероди-мер с тяжелой цепью HLA класса I. Этот белок имеет высо­кую степень гомологии с константными участками имму­ноглобулинов. Свободный Р₂-микроглобулин присутствует в сыворотке и моче. При заболеваниях, сопровождающих­ся активацией или гибелью лимфоцитов (лимфопролифе-ративных, аутоиммунных и вирусных заболеваниях, вклю­чая ВИЧ-инфекцию), а также при поражении почечных ка­нальцев концентрация этого белка в сыворотке повышает­ся. При ВИЧ-инфекции концентрация Р₂-микроглобулина в сыворотке минимальна во время бессимптомной фазы и значительно увеличивается на стадии СПИДа. Концентра­ция Р₂-микроглобулина, вместе с числом лимфоцитов CD4, имеет прогностическое значение и позволяет предсказать сроки развития СПИДа. Поданным одного крупного иссле­дования, концентрация этого белка является основным по­казателем скорости прогрессирования ВИЧ-инфекции. По­казано также, что при концентрации Р₂-микроглобулина бо­лее 3,8 мкг/мл СПИД в течение 3 лет развивается у 34% больных, тогда как при концентрации Р₂-микроглобулина

400 г

а

О

I

s ^ о

300

200

100

1 2 34 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15

Заболевания

Рисунок 308.21. Зависимость между риском заболеваний, отнесенных к диагностическим критериям СПИДа, и числом лимфоцитов CD4. Линия между черной и белой частями каждого столбика — медиана числа лимфоцитов CD4, нижний край каждого столбика — 25-й про-центиль, верхний край каждого столбика — 75-й процентиль, звездочка — среднее число лимфоцитов CD4 на момент постановки диагноза заболевания. 1 — герпес; 2 — опоясывающий лишай; 3 — криптоспоридиоз; 4 — саркома Капоши; 5 — криптококковый менингит; 6 — кан-дидозный эзофагит; 7 — впервые выявленная пневмоцистная пневмония; 8 — лимфома; 9 — СПИД-дементный синдром; 10 — прогресси­рующая мультифокальнаялейкоэнцефалопатия; 11 —ВИЧ-кахексия; 12 — повторная пневмоцистная пневмония; 13 — цитомегаловирус-ная инфекция; 14 — токсоплазменный энцефалит; 15 — диссеминированная инфекция, вызванная Mycobacterium avium-intracellulare. Moore R. D., Chaisson R. E., 1996.

34