Глава 308

действием ИЛ-2 усиливается как естественная, так и анти-телозависимая клеточная цитотоксичность.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

До того как был открыт ВИЧ, диагноз СПИДа ставили лишь на основании клинической картины. Открытие возбудителя в 1984 г. привело к быстрому развитию методов лаборатор­ной диагностики ВИЧ-инфекции. В марте 1985 г. в США была введена обязательная проверка доноров крови на ан­титела к ВИЧ, а с июня 1996 г. службы переливания крови стали применять ловушечный ИФА на антиген р24, позво­ляющий выявить ВИЧ-инфекцию в период между зараже­нием ВИЧ и появлением антител к вирусу. В настоящее вре­мя для диагностики ВИЧ-инфекции и контроля за течением заболевания используется множество лабораторных мето­дов исследования.

Диагностика ВИЧ-инфекции

Основные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфек­ции включают выявление антител к вирусу, вирусных анти­генов и выделение вируса в культуре клеток. Как уже гово­рилось, антитела к вирусу появляются в сыворотке боль­шинства ВИЧ-инфицированных через 4—8 нед после зара­жения.

Стандартным методом диагностики ВИЧ-инфекции слу­жит определение антител к ВИЧ с помощью ИФА. Этот ме­тод очень надежен, его чувствительность составляет более 99,5%. В большинстве диагностических лабораторий для про­ведения этого анализа используются коммерческие наборы, позволяющие определять антитела как к ВИЧ-1, так и к ВИЧ-2, поскольку в состав наборов входят естественные или рекомбинантные антигены ВИЧ обоих типов. Набор

антигенов в этих наборах постоянно обновляется, что по­зволяет повысить их чувствительность при определении ан­тител к новым штаммам ВИЧ, например штаммам группы О (рис. 308.5). Результаты анализа обычно расценивают как положительные, отрицательные или сомнительные. Однако специфичность этого метода мала. Так, при обследовании лиц из группы низкого риска ВИЧ-инфекции (например, доноров крови) оказалось, что лишь 13% людей с положи­тельными результатами ИФА были действительно инфици­рованы ВИЧ. Причинами ложноположительного результата могут быть наличие в сыворотке антител к HLA класса II и другим аутоантигенам, болезни печени или недавняя вакци­нация против гриппа. Таким образом, все случаи положи­тельного и сомнительного результатов ИФА должны быть проверены с помощью более специфичных методов.

Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции чаще всего используют иммуноблоттинг (рис. 308.19). Поскольку этот метод позволяет разделить антигены по молекулярной мас­се, то удается одновременно обнаружить антитела к несколь­ким антигенам ВИЧ. О наличии антител к определенному антигену судят по появлению окрашенной полосы на участ­ке мембраны, где локализован данный антиген. При отри­цательном результате иммуноблоттинга (отсутствии окра­шенных полос) положительные и сомнительные результаты ИФА расцениваются как ложноположительные. Если на мембране обнаруживают три полосы, соответствующие про­дуктам разных генов (gag, pol и env), то результат иммуноб­лоттинга — заведомо положительный. Однако в большинст­ве лабораторий результаты иммуноблоттинга оценивают в соответствии с критериями, принятыми Ассоциацией руко­водителей медицинских лабораторий США и Центром по контролю заболеваемости: результат иммуноблоттинга счи­тается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ — р24, gp41 и gp 120 (или gp 160). Положительный результат им-

1

ааа

YYY

ААА

ААА

ААА

ААА

ААА

ААА

ААА ААА

YYY

YYY

АА'Х ААА

АА'Х ААА

АА'Х ААА

АА'Х ААА

АХ'Х ААА

-рбб-

pal

. р31.

дад

-р55-

I

p24- _H

1

-р18-

-160 --120 -

•

Рисунок 308.19. Иммуноблоттинг. А. Принцип метода. Б. Результаты им­муноблоттинга. Для выявления анти­тел к ВИЧ использовали антигены ВИЧ-1. В сыворотке здорового чело­века, иммунизированного белками внешней оболочки ВИЧ, присутству­ют антитела только к этим вирусным белкам. В сыворотке ВИЧ-инфициро­ванного, зараженного ВИЧ-2, присут­ствуют антитела, перекрестно реаги­рующие с продуктами генов pol и gag ВИЧ-1.

1. Электрофоретическое разделение белков ВИЧ-1 по их молекулярной массе

2. Перенос вирусных белков на мембрану и ее инкубация в присутствии исследуемой

сыворотки

3. Инкубация мембраны в присутствии антител к человеческим иммуноглобулинам, конъюгированным с ферментом

4. Появление окрашенных попос на мембране после ее инкубации в присутствии субстрата фермента

1. Положительный результату ВИЧ- инфицированного, зараженного ВИЧ-1

2. Результат у здорового человека, иммунизированного белками внешней оболочки ВИЧ-1

3. Сомнительный результат у ВИЧ- инфицированного, зараженного ВИЧ-2

4. Сомнительный результат при наличии в исследуемой сыворотке антител, перекрестно реагирующих с вирусным антигеном р24

5. Отрицательный результат

Диагноз ВИЧ-инфекции подтвержден

Диагноз ВИЧ-инфекции исключен

¹ Если результат повторного иммуноблоттинга остается сомнительным, диагноз ВИЧ-инфекции маловероятен. Для окончательного исключения этого диагноза иммуноблоттинг повторяют еще два раза с интервалом в 3 мес (вместо иммуноблоттинга можно использовать методы определения антигена р24 или вирусной РНК).

Рисунок 308.20. Диагностический алгоритм при подозрении на ВИЧ-инфекцию. Результаты: (+) — положительный; (—) — отрицатель­ный; (+/—) — сомнительный.

муноблоттинга подтверждает диагноз ВИЧ-инфекции. Ес­ли результат иммуноблоттинга нельзя расценить как поло­жительный или отрицательный, его считают сомнительным. Наиболее вероятная причина сомнительного результата — наличие в сыворотке здорового человека антигенов, пере­крестно реагирующих с антителами к каким-либо антиге­нам ВИЧ, чаще всего с антителами к р24 и р55. Сомнитель­ный результат иммуноблоттинга может быть получен и при обследовании ВИЧ-инфицированных, у которых гумораль­ный иммунный ответ на вирус находится на ранней стадии развития. В связи с этим при получении сомнительных ре­зультатов иммуноблоттинга его обязательно повторяют че­рез месяц. Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции мож­но использовать также ловушечный ИФА на антиген р24 и методы выявления вирусной РНК (см. ниже). Иммуноблот­тинг прекрасно подходит для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции, но не годится как предварительный метод диаг­ностики: у 20—30% лиц с отрицательными результатами ИФА и ПЦР при иммуноблоттинге обнаруживается как ми­нимум одна окрашенная полоса. Обычно эти полосы окра­шены слабо. Они образуются в результате перекрестных ре­акций с антигенами, не связанными с ВИЧ. Тем не менее при получении таких результатов иммуноблоттинга необхо­димы дальнейшие исследования (ПЦР для выявления ви­русной РНК или ДНК, метод разветвленной ДНК или лову­шечный ИФА на антиген р24), поскольку они позволяют подтвердить диагноз ВИЧ-инфекции на самых ранних ста­диях.

Диагностический алгоритм при подозрении на ВИЧ-ин­фекцию приведен на рис. 308.20. В первую очередь проводят ИФА. Если результат исследования отрицателен и отсутст­вуют указания на возможность недавнего заражения (в тече­ние 3 мес перед обследованием), диагноз ВИЧ-инфекции исключают. Исследование повторяют при подозрении на недавнее заражение, а также при положительном (или со­мнительном) результате первого исследования. В послед­нем случае отрицательный результат двух последовательных исследований исключает диагноз ВИЧ-инфекции и свиде­тельствует о технических ошибках, допущенных при первом исследовании. Если результаты повторных ИФА положи-

31

ВИЧ-инфекция и СПИД

тельны или сомнительны, проводят иммуноблоттинг. Поло­жительный результат иммуноблоттинга служит подтвержде­нием диагноза ВИЧ-инфекции. При отрицательном резуль­тате иммуноблоттинга результаты ИФА считают ложнопо-ложительными и исключают диагноз ВИЧ-инфекции. Если результат иммуноблоттинга сомнителен, то приблизитель­но через месяц это исследование повторяют. Кроме того, до­полнительно можно провести исследования с помощью ло-вушечного ИФА на антиген р24 или ПЦР для определения вирусной ДНК или РНК. Если результаты дополнительных исследований отрицательны, а окраска полос при повтор­ном иммуноблоттинге не претерпела изменений, то диагноз ВИЧ-инфекции исключают. При усилении окраски полос или положительном результате хотя бы одного из дополни­тельных исследований ставят предположительный диагноз ВИЧ-инфекции, и иммуноблоттинг проводят повторно че­рез несколько месяцев. Положительный результат иммуноб­лоттинга подтверждает диагноз.

Существуют разнообразные методы прямого выявления ВИЧ и его компонентов (табл. 308.10). Как уже говорилось, эти методы используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции при сомнительных результатах иммуноблоттин­га. Кроме того, некоторые из этих методов позволяют оце­нить эффективность антиретровирусного лечения. Наибо­лее простой из них — ловушечный ИФА на антиген р24. Это модификация ИФА, при которой антитела к вирусному бел­ку р24 иммобилизируют на твердой подложке. При добавле­нии сыворотки больного происходит сорбция антигена (бел­ка р24) на этих антителах. Свободный белок р24 выявлен приблизительно у 30% ВИЧ-инфицированных. Однако в крови белок р24 находится не только в свободной форме, но и в виде иммунных комплексов, поэтому обработка проб слабой кислотой с целью расщепления иммунных комплек­сов увеличивает этот показатель до 50%. В течение несколь­ких недель после заражения, до развития гуморального им­мунного ответа на ВИЧ, концентрация белка р24 в сыворот­ке ВИЧ-инфицированных резко возрастает. При появлении в крови антител к белку р24 концентрация этого антигена снижается. На поздних стадиях ВИЧ-инфекции, сопровож­дающихся выраженной виремией, концентрация белка р24 (особенно в составе иммунных комплексов) в сыворотке вновь возрастает. Патогенетическая роль свободного бел­ка р24 неизвестна, однако показано, что при его наличии в сыворотке во время бессимптомной фазы риск развития СПИДа в течение следующих 3 лет в среднем в три раза вы­ше, чем в отсутствие этого антигена, несмотря на примерно одинаковое исходное число лимфоцитов CD4 у всех боль­ных. Кроме того, в ходе клинических испытаний установле­но, что антиретровирусное лечение приводит к снижению концентрации белка р24 в сыворотке ВИЧ-инфицирован­ных. Однако целесообразность определения этого антигена для оценки эффективности антиретровирусного лечения не доказана — существуют гораздо более чувствительные мето­ды ПЦР и разветвленной ДНК (см. ниже). В настоящее время ловушечный ИФА на антиген р24 с успехом применяется для диагностики ВИЧ-инфекции во время острой лихорадочной фазы, когда концентрация этого антигена высока, а антител к белкам ВИЧ, наоборот, низка. Кроме того, в США этот ме­тод используется вместе с ИФА для проверки донорской крови на ВИЧ.

Методы, основанные на ПЦР, получили широкое распро­странение в диагностике инфекционных заболеваний. Бла­годаря применению этих методов удалось достичь значи­тельного прогресса в понимании патогенеза ВИЧ-инфек-

32