- •Гомель 2010 г.
- •Глава 1 Обзор литературы
- •1.1Helicobacter pylori-что это такое?
- •1.2Факторы вирулентности:
- •Глава 2 Методы диагностики Helicobacter pylori
- •2.1 Методы диагностики Helicobacter pylori :
- •Глава 3 Материалы и методы исследования
- •Глава 4 Результаты собственных исследований
- •Глава 1
- •1.1 Helicobacter pylori что это такое?
- •1.2 Факторы вирулентности:
- •Глава 2
- •2.1 Методы диагностики Helicobacter pylori :
- •Глава 3
- •3.1 Материалы исследования:
- •3.2 Методы исследования:
- •3.2.2 Необходимое оборудование и расходные материалы:
- •1 Этап - выделение днк из биопроб:
- •2 Этап - проведение пцр (амплификация):
- •3 Этап - детекция продуктов амплификации:
- •1. Комплект для пробоподготовки (выделения днк)
- •2. Комплекты для проведения пцр (амплификации)
- •3. Комплект для детекции продуктов амплификации
- •3.3 Проведение исследования
- •3.3.1 Взятие,доставка и хранение материала:
- •3.3.2 Выделение днк из биопроб:
- •3.3.3 Проведение пцр(амплификация):
- •3.4 Детекция продуктов амплификации:
- •3.5 Анализ результатов:
- •3.6 Выявление гена CagA h. Pylori
- •Глава 4
- •4.1Таблица.6 Эндоскопические и гистологические проявления инфекции h. Pylori у носителей:
- •4.2 Анализ полученных материалов эндоскопического исследования
- •4.3 Анализ полученных материалов эндоскопического исследования
Глава 3
Материалы и методы исследования
3.1 Материалы исследования:
В исследовании участвовало население гомельской области:
Случайная репрезентативная выборка взрослого населения: 71 человек в возрасте 13-83лет, из них 22 мужчины (средний возраст 38,4 года) и 49 женщин (средний возраст 40,6 года).
Для выявления гастроэнтерологической патологии у обследуемых лиц использовали данные эндоскопических и гистологических исследований, а так же данные полученные в молекулярно-генетической лаборатории, на наличие у обследуемых Helicobacter pylori .
Биопсийный материал обследуемых лиц исследовался методом ПЦР-Хеликопол НПФ «ЛИТЕХ»,г.Москва,для определения присутствия Helicobacter pylori в исследуемых образцах, а выявление гена CagA H.pylori проводили при помощи двух наборов: первый коммерческий набор реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА ,второй набор состоит из последовательности праймеров взятых нами из открытого источника, которые были синтезированы ОДО «Праймтех» г. Минск, Беларусь.[23]
3.2 Методы исследования:
Методика проведения исследования клинического материала (биоптат слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки) на наличие ДНК Хеликобактер пилори методом ПЦР:
«Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ (Helicobacter pylori)»
3.2.1Принцип работы метода:
В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК микроорганизма путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК-мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК.
Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозид-трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени.
Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94оC происходит разделение цепей ДНК, затем при 57-62оС - присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72оC протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5’-3'.
В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 35 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для его детекции с помощью электрофореза.
Проведение ПЦР-анализа включает 3 лабораторных этапа:
1. обработка клинических проб (выделение ДНК);
2. постановка реакции ПЦР (амплификация);
3. детекция продуктов амплификации (в данной методике - электрофоретическое разделение продуктов в агарозном геле).
3.2.2 Необходимое оборудование и расходные материалы:
1 Этап - выделение днк из биопроб:
- ламинарный бокс 2 класса защиты;
- твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорф, поддерживающий температуру до 99оС;
- высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8-12 тыс.об/мин;
- центрифуга для пробирок 50 мл 1,5-3тыс.об/мин;
- микроцетрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин (или вортекс);
- пипетки-дозаторы переменного объема ( 5-50; 20-200; 100-1000 мкл);
- вакуумный аспиратор (насос) с колбой-ловушкой;
- штатив для хранения пробирок 1,5 мл;
- штатив для пробирок 1,5 мл «рабочее место»;
- одноразовые наконечники для дозаторов до 200 мкл и до 1000 мкл;
- холодильник с морозильной камерой для хранения клинического материала;
- одноразовые перчатки;
- комплект «Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ»