8. Приготовление препаратов-мазков (нативных и окрашенных)

Нативные препараты готовят для исследования живых неокрашенных бактерий. Наибольшее распространение получили метод висячей капли, микрокамеры с плотными средами и негативные методы исследования живых бактерий. Для прижизненного исследования часто применяются исследование в темном поле и фазово-контрастная микроскопия. Подобные приемы часто используют для диагностики сифилиса и предварительной диагностики диарей, вызванных кампилобактерами, а также для определения подвижности микроорганизмов.

Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их. Для приготовление мазков тампоны, содержащие микроорганизмы, прокатывают по предметному стеклу. Мазки из материалов со слизистой или грубой консистенции готовят растиранием их между 2-мя предметными стеклами. Прозрачные жидкости можно нанести виде капли на предметное стекло, при этом границы капли желательно обвести маркером. Лучшие результаты дает предварительное центрифугирование; затем осадок наносят на стекло; если он густой, его можно распределить с помощью стеклянной палочки.

Фиксация. В практической бактериологии наиболее распространена термическая фиксация (над пламене горелки). Для более детального изучения структуры клеток применяются фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем химического их смешивания. Для светооптической микроскопии используют формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осьмиевой кислоты идр. Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нанося фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.

9. Простые способы окраски препаратов-мазков

Стандартные красители, используемые для окраски бактерий – карболовый фуксин Циля, фуксин Пфайффера и метиленовый синий по Леффлеру.

10. Сложные способы окраски бактерий

Для получения более информативных результатов в светооптической микроскопии используют специальные и дифференцирующие методы окраски. Среди специальных методов окраски наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена. Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур:

Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод более прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4.

Для окраски жгутиков предложены методы Леффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата(обычно растворами танина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).

Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Леффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки – в розовый.

11.Морфология грибов.

Грибы и простейшие имеют четко ограниченное ядро и относятся к эукариотам. Грибы крупнее бактерий, в эволюционном плане близки к растениям (наличие клеточной стенки, содержащей хитин или целлюлозу, вакуолей с клеточным соком, неспособность к перемещению, видимое движение цитоплазмы). Ядерный материал грибов отделен от цитоплазмы ядерной мембраной. Дрожжевые грибы образуют отдельные овальные клетки. Плесневые грибы формируют клеточные нитеподобные структуры- гифы. Мицелий- переплетение гифов- основная морфологическая структура. У низших грибов мицелий одноклеточный, не имеет внутренних перегородок (септ). Грибы размножаются половым и бесполым (вегетативным) способом. При вегетативном размножении образуются специализированные репродуктивные структуры- споры- конидии. Они могут располагаться в специализированных вместилищах- спорангиях (эндоспоры) или отшнуровываться от плодоносящих гиф (экзоспоры). Реже наблюдают образование спор внутри клеток (оидии), являющихся сегментами гиф. Дрожжевые клетки размножаются почкованием, мицелий не образуют. Половое размножение включает взаимодействие специализированных клеток, имеющих существенные различия в морфологии у различных грибов и часто используемых как дифференциально- диагностический признак.

Для большинства видов грибов, имеющих медицинское значение, характерно наличие конидий (или экзоспор), являющихся формами неполового размножения. Их классификация во многом основывается на морфологических формах конидий. Их наиболее частые формы- бластопоры, хламидоспоры, артроспоры, конидиоспоры.

Бластоспоры- простые структуры, котрые образуются в результате почкования, с последующим отделением почки от родительской клетки, например у дрожжевых грибов.

Хламидоспоры образуются в результате увеличения гифальных клеток с образованием толстой оболочки, защищающей споры от неблагоприятных условий окружающей среды.

Артроспоры- споры, образующиеся путем фрагментации гиф на отдельные клетки. Они встречаются у дрожжеподобных грибов, возбудителя кокцидиоидоза, тканевых форм дерматофитов в волосе, кожных чешуйках и в ногтях.

Конидиоспоры- зрелые наружные споры, возникающие на дифференцированных конидиофорах (конидионосцах), отличающихся от других нитей мицелия по форме и размерам (у аспергилл, пеницилл) или располагающиеся по бокам и на концах любой ветви мицелия, прикрепляясь к ней непосредственно или тонкой ножкой.

К эндоспорам совершенных грибов относятся спорангиоспоры мукоровых грибов, развивающихся в специальных органах (спорангиях), располагающихся на вершине спорангиеносца. Споры освобождаются при разрыве стенки спорангия.

Эндоспоры обнаруживают также у тканевых форм возбудителей кокцидиоидоза. Они развиваются в круглых образованиях - сферулах, при разрыве стенки зрелой сферулы попадают во внешнюю среду.

Основное функциональное отличие спор у бактерий и грибов: у бактерий споры обеспечивают переживание в неблагоприятных условиях окружающей среды, у грибов образование спор- способ размножения.