Лекция № 3

ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматография — физико-химический метод, применяемый для выделения, разделения и идентификации разнообразных веществ природного и синтетического происхождения и качественного и количественного анализа их смесей.

3.1. Основной принцип хроматографии

Разделение веществ основано на различии в скоростях движения концентрационных зон веществ, перемещающихся в потоке подвижной фазы (элюента) вдоль слоя неподвижной фазы (адсорбента).

3.2. Классификация хроматографических методов

а) По агрегатному состоянию подвижной фазы:

газовая жидкостная

б) По агрегатному состоянию неподвижной фазы:

в) По доминирующему механизму взаимодействия разделяемых веществ с подвижной и неподвижной фазами:

● адсорбционная — основана на различии в физической адсорбции веществ;

● молекулярно-ситовая — основана на различной проницаемости молекул веществ в неподвижную фазу;

● ионообменная — основана на различной способности веществ к ионному обмену с адсорбентом;

● биоспецифическая — основана на высокой специфичности связывания веществ с неподвижной фазой;

● распределительная — основана на различии коэффициентов распределения веществ между подвижной и неподвижной жидкими фазами.

г) По геометрии неподвижной фазы: колоночная (в том числе капиллярная) и плоскостная (бумажная и тонкослойная).

3.3 Описание некоторых хроматографических методов

Колоночная жидкостно-твердофазная хроматография

Адсорбент — силикагель или оксид алюминия, элюент —органический растворитель или смесь растворителей.

Применяется для разделения макроскопических количеств веществ, для очистки органических природных и синтетических веществ.

Газо–жидкостная хроматография (ГЖХ)

Схема газо-жидкостного хроматографа

Хроматограмма трехкомпонентной смеси

Применяется для анализа и разделения разнообразных смесей веществ с молярной массой до 300 г/моль, в том числе и для анализа газов.

Высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления (вэжх)

Схема жидкостного хроматографа высокого давления

ВЭЖ хроматограмма смеси аминокислот

Применяется для анализа сложных смесей, в том числе биологических объектов (установления аминокислотного состава белков, анализа нуклеиновых кислот и т.д.).

Молекулярно–ситовая хроматография

Адсорбенты — неионогенные гели — твердые пористые тела (цеолиты, сефадексы, амберлиты и т.д.). Элюент —органический растворитель или вода.

●.— большие молекулы, O — гранулы геля, . — малые молекулы

Схема проведения молекулярно-ситовой хроматографии

Применяется для разделения смесей белков, нуклеиновых кислот, вирусов, отделения белков от низкомолекулярных примесей.

Ионообменная хроматография

Адсорбент — ионообменные смолы (катиониты или аниониты). Элюент — чаще всего вода.

Пример разделения смеси α-аминокислот на сульфированном полистироле в виде натриевой соли RSO₃^–Na⁺:

Ak⁺ + RSO₃^–Na⁺   RSO₃^–Ak⁺ + Na⁺

Применяется для разделения смесей фенолов, карбоновых кислот (на анионитах), аминосахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пуриновых, пиримидиновых и других оснований (на катионитах), аминокислот, белков, нуклеиновых кислот.

Биоспецифическая хроматография

Адсорбент — носитель биоспецифического лиганда, взаимодействующего с выделяемым веществом на основании биологической функции последнего, например, лиганд — антиген, выделяемое вещество — антитело. Элюент — вода.

L — лиганд ;L̅ — иммобилизованный лиганд; M — биологически активное вещество; ML̅ — биоспецифический комплекс;  — примеси;  — несорбирующиеся компоненты смеси.

Механизм биоспецифической хроматографии

Применяется для выделения специфических нуклеиновых кислот, гормонов, вирусов, антител, антигенов, ферментов, рецепторов лекарственных препаратов, клеток. Позволяет выделять следовые количества веществ.

Распределительная хроматография

Бумажная хроматография

Адсорбент — хроматографическая бумага — носитель неподвижной фазы – воды.

Подвижная фаза — органический растворитель или смесь растворителей.

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Адсорбент — силикагель или другой порошок с развитой поверхностью, закрепленный на алюминиевой фольге.

Подвижная фаза — органический растворитель или смесь растворителей.

Схема анализа смеси веществ с помощью бумажной хроматографии

(на примере восходящей хроматографии)

Применяется для анализа смесей веществ, идентификации и проверки чистоты отдельных веществ, в том числе лекарственных препаратов. Можно использовать микроскопические количества веществ (от 0,001 до 1 мкг)