17. Свойства плазмидных векторов

Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природные (немодиф-ные, несконстр-ные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для «высококачественного» вектора свойств. К таким важным свойствам относятся:

1) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.;

2)наличие уникального сайта рестрикции (разрез цепочки ДНК, осуществляемый специальным ферментом (рестриктазой), в который может быть осуществлена вставка;

3) наличие одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Поэтому плазмидные вектора приходится создавать с помощью генной инженерии.

18. Ферменты клонирования в технологии р-днк

Технология рРНК – совокуп-сть экспер. методов переноса ген. мат-ла (ДНК) из одного организма в другой. Клонирование – процедура вращивания и отбора клонов, несущих нужные рРНК. В бол-ве случаев при клон-ии во всём мире в кач-ве реципиентных генов исп-ют штаммы E.coli, кот. называют «рабочей лошадкой».

Конструирование рекомб. мол-л ДНК осущ-ся с помощью ф-тов: рестрикции(гидролиза): рестриктазы; легирования (сшивания): лигазы; синтеза: обратные транскриптазы.

Эндонуклеазы – ф-ты рестрикции, способные: узнавать опред. послед-сти осн-ий в 2-ух спирал. ДНК, расщеплять обе цепи ДНК.

С их помощью исследуют: стр-ру хромосом, послед-сти нуклеотидов в ДНК (секвенирование). Произ-ят выделение генов, получение новых м-л ДНК для клон-ия. Рестрицирующие эндонуклеазы обнаружены у разл. прокариот. Биол. роль: расщеплять чужеродную ДНК, собств. ДНК при этом не расщепляется, т.к. участки ДНК, узнаваемые собств. рестриктазами в клетке метилированы.

Рестриктазы разделены на 3 группы в зав-ти от доины узнаваемой послед-сти: 1) узнают тетрануклеотиды (Alu-I) из Artrobacter luteus; 2) узнают пентануклеотиды (EcoR-II) из E.coli; 3) узнают гексануклеотиды (Ecor-I) из E.coli. Их название сокращено до 3 букв названия м.о.+обозначение штамма римской цифрой.

Производимые в двух цепях разрывы м.б. расположены либо со сдвигом отн-но друг друга на 1-2 осн-ия, либо строго против друг друга (пол-тся «тупые» концы).

В наст. время рестриктазы дел-тся на 3 класса с учётом метилирования сайта и сайта посадки (RMS-система: R-рестриктаза, M-сайт метилирования, S-сайт посадки ф-та):

I класс: рестриктазы, кот. расщеп. ДНК в произвол. точках с обр-ем различ. фрагментов ДНК; II класс: ф-ты, д. кот. сайты рестрикции и посадки совпадают. Образующиеся фрагменты рестрикции воспроизводятся по длине; III класс: из фага Р-1 объединяют все прочие эндонуклеазы.

Число узнаваемых рестриктазами нукл. послед-тей варьирует от 4 до 13. Рестриктазы расщепл. ДНК через 250 нуклеотидов, исходя из ф-лы уⁿ, где у – кол-во нуклеотидов (Г,У,Т,А), n-число повторов сайтов рестрикции.

Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове м-лы, т. е. для восст-ия связи между З'-ОН концевой группой одной цепи и 5'-фосфатной группой другой. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4 (катал-ет образ-ие фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов; «сшивает» тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом).

Технология рек. ДНК в вопросе №16 (если понадобится)