15. Фенотипическое выражение генов

Ф-ии гена и его влияние на фенотип зависят от физического положения гена в генетической системе (эффект положения), от совокупности остальных генов (генотипической среды) и от внешних условий. Фенотипическое выражение гена - экспрессивность, так же как и его проявление - пенетрантность, т. е. наличие или отсутствие контролируемого данным геном признака, могут варьировать в зависимости как от внешних условий, так и от генотипа. Под влиянием различных внешних воздействий гены могут изменяться - мутировать. К независимому мутированию способны также элементарные единицы, входящие в состав гена. Гены контролируют процессы синтеза белков в клетках и что генные мутации (изменения химической структуры генов) ведут к изменению химической структуры белков (что в ряде случаев сводится к замене одной аминокислоты другой).

При разных условиях у особей со сходным генотипом фенотипическое выражение данного гена может быть различно. Так, мутация дрозофилы «abnormal abdomen» (фенотипически проявляется в неправильном расположении полосок окраски на брюшке) обнаруживается в фенотипе только при выращивании личинок мух на влажном корме; при использовании сухого корма мутанты ничем не отличаются от нормальных мух.

Кроме того, может варьировать (даже при 100\%-ной пенетрантности) степень фенотипического проявления гена. Признак может быть выражен сильнее или слабее, проявляться более или менее отчетливо в зависимости от внешних условий или от взаимодействия генов друг с другом. Если данный признак сходно выражен у разных особей в данных условиях, говорят о постоянной экспрессивности контролирующего этот признак гена, если же степень выраженности признака варьирует — об изменчивой экспрессивности.

16. Скрининг трансформированных клеток

Эксперименты с рекомбинантной ДНК прово­дят по следующей схеме:

• Из организма — донора нужных генов — экс­трагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чу­жеродная ДНК), подвергают ее фермента­тивному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирую­щий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирую­щий вектор—встроенная ДНК»).

• Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и пере­дается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

• Идентифицируют и отбирают клетки, несу­щие рекомбинантную ДНК (трансформиро­ванные клетки).

• Получают специфический белковый про­дукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Т.к. при рестрикции ДНК обр-ся смесь фрагментов и после из лигирования с векторной ДНК обр-ся множ-во комбинаций необходимо уметь распознавать те реципиентные клетки, кот. сод-ат ДНК с встраиваемой послед-тью (ДНК-мишени). Для этого исп-ют различные системы скрининга (отбора).

Скрининг – комплекс методов идентификации единичного объекта с нужной рДНК путём перебора большого числа объектов.

Скрининг с помощью гибридизации: нужную нуклеотидную послед-сть в образце ДНК можно обнаружить с помощью ДНК-зонда, спаривающегося только с искомой послед-тью. Для этого ДНК сначала переводят в одноцепочечную форму, подвергнув её тепловой обработке или воздействию щелочью.

После трансформации высевают клетки на чашки с пит. средой и переносят выросшие колонии на твёрдую подложку( нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр); проводят лизис клеток, затем депротеинизацию и денатурацию ДНК; фиксируют на ДНК подложке. Наносят на фильтр меченый зонд и проводят отжиг, а затем радиоавтографию. Колонии на исходной чашке, кот. сод-ат гибридизовавшуюся ДНК, выделяют и культивируют. С помощью гель-электрофореза и картирования определяют размер каждого фрагмента (вставки) и идентифицируют аналогичные фрагменты или фрагменты с перекрывающимися последовательностями (для определения клона, содержащего искомый ген целиком).

Иммунологический скрининг. Клет­ки после транстформаиии высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформиро­ванных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку так, чтобы их расположение в точности соответствовало таковому на чашке. 2. Клетки подвергают лизису, белки фиксируют на фильтре. 3. Наносят на фильтр первые антитела, которые свя­зываются только с искомым белком. 4. Несвязавшиеся первые антитела удаляют, наносят на фильтр вторые антитела, специфичные в отношении первых антител, связанные с ферментом (например, щелочной фосфатазой).5. Смывают с фильтра все несвязавшиеся вторые антитела и наносят на него бесцветный субстрат, при гидролизе которого образуется окрашенный продукт. Гидролиз может произойти только в присутствии вторых антител. 6. Отбирают колонии на чашке, соответствующие окрашенным пятнам на фильтре, и культивируют их. В них может содержаться рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, гомологичный первым антителам.