Механизм катаболической репрессии в лактозном опероне.
Оперон – это участок ДНК, огранич. с 1й стороны промотором (местом присоед-я РНК-полимеразы), с др. – терминатором (местом ее отсоединения). Оперон кодирует одну мРНК, из которой могут синтез-сянеск. белков. В опероне имеется оператор – регуляторный участок, “разреш.” или “не разреш.” работу РНК-полимеразы и распол. после промотора.
Структурулактозного оперона E.coli открыли франц. микробиологи Ф. Жакоб и Ж. Моно в 1969 г. Lac-оперон объединяет 3 структурных гена – z, y и a, кодир. ферменты для усвоения лактозы: Z (β-галактозидазу), Y (галактозидпермеазу) и A (галактозидтрансацетилазу). Механизм регуляции lac-оперона наз-ся катаболическая репрессия – мех-м остановки экспрессии структур.генов в случае закрытого оперона (принцип обратной связи). Ферменты, синтез.в клетке по такому принципу, наз-сяиндуцибельными, т.е. кодируемый ферм. синтез-сятолько в присутствии необх. субстрата.
Смысл: появление в среде субстрата (лактозы) “вкл” синтез расщепл. ее белков-ферм. Если лактозы в среде нет, то синтез ферм. дляеерасщепл.прекращ. Такую регуляцию обесп.2 механизма – индукции ферментов метаболизма лактозы и катаболической репрессии.“Вкл-выкл” синтеза ферм. Z, Y и A обесп-ся конститутивным белком – lac-репрессором. Этот белок закодирован в ДНК E. coli в гене-регуляторе, не вход.всостав lac-оперона. Постоянно синтез.вклетке, lac-репрессор связ-ся с оператором. В связанном состоянии lac-репрессор препятствует работеРНК-полимеразы, т.е. она не может считывать гены z, y и a и построить мРНК =>ферм. Z, Y и A не синтез.
Лактоза в среде выступает в качестве индуктора:меняет конформациюмол-л lac-репрессора =>lac-репрессором теряет спос-тьприсоед. коператору. Свободный оператор “разрешает” РНК-полимеразе построить мРНКдля синтеза ферм. Z, Y и A, то есть происх. индукциясинтеза этих белков. Ферменты Z, Y и A начинают расщеплять лактозу,↓ее конц-ю =>инактивирующее воздействие лактозы на lac-репрессор исчезает,конформация его восст-ся, и он опятьприсоед. к оператору, блокируя lac-оперон.
Рис. Репрессия (а) и индукция (б) в лактозном опероне. П-промотор, Р-ген-регулятор, Т – терминатор, А - участок прикрепления белка-активатора, О – оператор, z,y,a – структурные гены.
Встраивание днк-мишени в вектор.
Технология рекомбинантной ДНК (р-ДНК) –сумма методов переноса ген. мат-ла из одного орг.в др.по схеме:1. Из орг.донора экстрагируют нативную ДНК (клонируемую, встраиваемую, ДНК-мишень, чужеродную). 2. Ее подверг.ферм. гидролизу (расщепляют, разрезают). 3. Фрагменты соединяют (сшивают, лигируют) с др. ДНК (векторомклонир-я) =>образуется новаярекомб. молекула – ДНК-вектор+ДНК-мишень. 4. Эту конструкцию вводят в кл.хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам (опред.%). Этот процесс наз-сятрансформацией клетки хозяина. 5. Трансформир. кл. высевают на селективные среды и отбирают кл., несущие р-ДНК (скрининг). 6. При культивировании трансформир. кл. получают специф. белки, синтез-мыекл. хозяина по информ-и ДНК-мишени; эти белки служат подтверждением клонирования встроенного гена. Конструир-е р-ДНК осущ.с пом. ф-тов: рестрикции (гидролиза), лигирования (сшивания), синтеза (обратная транскриптаза).
Работа клонирующего вектораpBR322. Очищенную кольцевую плазмидуpBR322 обрабатывают рестриктазой в одном сайте → образ.линейная мол-ла с липкими концами. Эти мол-лы смешивают с донорной ДНК, содерж. нужный ген и обработанной этой рестриктазой. Липкие концы двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образ.гибридных мол-л. Далее смесь обраб. ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТФ→ образ.много комбинаций фрагментов и нежелательные продукты. Чтобы ↓ кол-во последних, рестрицированнуюплазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, отщепл. от линейной мол-лы 5'-фосфатные группы: ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированнойплазмидной ДНК. Собственно р-ДНК, хотя имеет 2 одноцепочечных разрыва, удерж. за счет 2х фосфодиэфирных связей, образ.с пом. ДНК-лигазы между дефосфорилированнойплазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК. После репликации в трансформированной клетке одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина (см. рис.).
У гибридного вектора в новой клетке есть 2 пути: 1) вектор встраивается в ДНК бактерии (редко, ≈ 1 клетка из 1000); 2) гибридная плазмида образ.отдельно от основной ДНК. После введения гибридной ДНК (вектор с ДНК-мишенью) в клетку хозяина – трансформация генома – происх. ее репликация и образ.новые кольцевые мол-лы уже без разрывов. Для сохранения р-ДНК в клетке хозяинанеобх., чтобы в нем не было генов, кодирующих синтез соотв. рестриктаз. Затем проводят идентификацию и отбор (скрининг) трансформированных клеток с р-ДНК.
Рис. Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор. Плазмидную ДНК, обраб. рестриктазой и щелочной фосфатазой, смеш. с рестрицированной донорной ДНК с нужным геном, и добавл. ДНК-лигазу. 2 из 4 1-цепочечных разрыва устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образ.фосфодиэфирным связям. После введения гибридной ДНК в клетку-хозяина происходит ее репликация и образ.новые кольцевые мол-лы уже без разрывов.