24. Репликация днк эукариот

Для изучения применяли метод радиоавтографии с Н₃⁺-тимидином: в к-ру клеток человека на корот. время вводят радиоактивную метку.Затем клетку мягко лизируют. ДНК дают расправиться на пов-ти предметного стекла, покрытого фоточувствительной эмульсией. после чего автограф изучают в световом микроскопе. Реплицировавшаяся ДНК выявляется в виде цепочки гранул серебра. Этим методом м.определить скорость и направление движения репликационной вилки.

Выявили, что реплик. вилки у эукариот перем-тся на 50 нуклеотидов/сек, т.е. в 10 раз медленнее, чем у бактерий. Это связано с трудностью распаковки эукариот. хромосом (от гистонов). Средняя хромосома чел-ка состоит из одной м-лы ДНК, содержащей 150 млн.п.н.Для репликации такой м-лы одной репликац. вилкой потреб-тся 800 ч (0,02*150*10⁶=3*10⁶ сек, где 0,02 - время на синтез 1 нуклеотида. Выяснили, что по каждой эукариот. хромосоме движ-ся одноврем-но много вилок. Далее обнаружили: 1) сайты инициации репликации обычно инициируются группами (по 20-80 сайтов). Их называют репликац. единицами

2) В ходе фазы S актив-ся все новые единицы, пока вся ДНК не будет реплицирована.

3) отдельные точки начала репликации внутри репликац. единицы отстают друг от друга от 30 тыс. до 300 тыс.п.н. Т.е. в среднем на одну петлю хроматина м. приходиться одна точка начала репликации.

4) В каждой точке инициации образуется пара репликац. вилок и по мере их расхождения от сайта инициации формируется репликац. глазок. Остановка вилки происходит только при столкновении с репликац. вилкой, движущейся в противопол. направлении или при достижении конца хромосомы. т.е. по каждой хромосоме эукариот м. двигаться независимо друг от друга много репликац. вилок (глазков), образующих 2 целые дочерние спирали ДНК.

У эукариот кодон инициации всега АУГ (соот-ет метионину), у бактерий – АУГ (реже ГУГ).

25. Репликация днк прокариот

2-ух цеп. ДНК и РНК(у вирусов) м.служить матрицами для синтеза ДНК. Предшеств-ми синтеза ДНК явл-ся дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты. (В основе метода:ДНК осаждается кислотами, а нуклеотиды-предшественники остаются в растворе; включение меченных предшественников ДНК. Для исследования выбрали бактерии Е. coli→деление этих клеток происходит всего лишь за 20 мин (время генерации→их можно выращивать в больших количествах. Экстракт Е. coli инкубировали с радиоактивным дезокситимидин-5'-трифосфатом. Радиоактивность обнаруживалась в небол. кол-вах.

Синтез ДНК осущ-ет ДНК-полимераза I - это единая полипептидная цепь с массой 109 кДа; кат-ет послед-ое присоед-ие ДНК-звеньев к цепи ДНК.

Компоненты, необходимые для синтеза: 1) 4 дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфата(dNTP): dATP, dGTP, dTTP и dCTP; 2) ионы Mg2+; 3) затравочная цепь, или затравка, со свободной 3'-ОН группой; 4) матричная ДНК.

Реакция элонгации (удлинения) цепи, катализируемая ДНК-полимеразой, происходит путем нуклеофильной атаки 3'-ОН-концом матрицы ближайшего к рибозе атома фосфора очередного dNTP. В результате образуется фосфодиэфирный мостик и одновременно высвобождается пирофосфат. Элонгация цепи ДНК происходит в направлении 5'-3'. За секунду одна молекула ДНК-полимеразы I присоединяет примерно 10 нуклеотидов. Полимеризация процессивна, т. е. фермент присоединяет много нуклеотидов, оставаясь связанным с одной матрицей.

Репликационная вилка – участок ДНК, где происходит одновр-ое расплетение и синтез ДНК. Активное расплетание родительской двойной спирали под действием фермента — белка rep(хеликаза). На разделение каждой пары оснований затрачиваются примерно две молекулы АТР. Затем каждая из разделенных цепей родительской ДНК взаимодействует с несколькими молекулами белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК (ОЦ-связывающий Б, дестабилизирующий спираль (Б ДС), или плавящий Б). Роль ОЦ-связывающего белка - стабилизировать одноцепочечные участки ДНК для выполнения ею роли матрицы.При расплетании ковалентно замкнутой кольцевой молекулы ДНК возникают топологические проблемы, так как расплетание двойной спирали вызывает образование положительных супервитков → вносят ДНК-гиразу (Эта топоизомераза удаляет положительные супервитки, внося одноцепочечные разрывы и затем заделывая фосфодиэфирные связи в остове ДНК, ДНК-гираза может активно вводить отрицательные супервитки в ковалентно замкнутую кольцевую ДНК за счет энергии гидролиза АТР).

Репликация ДНК – полуконсервативный процесс, т.к. одна цепь ДНК – родит-ая, а вторая – достраивается заново в процессе репликации.

Цепи родительской ДНК антипараллельны. Следовательно, общее направление синтеза ДНК должно быть 5'—>3' для одной из дочерних цепей и 3'—>5' для другой. Однако все известные ДНК-полимеразы синтезируют ДНК в направлении 5'—>3', а не 3'—>5'.

Кажущийся рост второй цепи ДНК объяснил Оказаки, который обнаружил, что значительная часть новосинтезированной ДНК существует в виде коротких фрагментов. Такие фрагменты длиной около 1000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки) существуют в течение непродолжительного времени в непосредственной близости от репликационной вилки. По мере прохождения репликации эти фрагменты соединяются друг с другом ковалентно под действием ДНК-лигазы и образуют одну из дочерних цепей. Другая новая цепь синтезируется непрерывно или почти непрерывно. Та цепь, которая образуется из фрагментов Оказаки, называется отстающей цепью, а та, что синтезируется без разрывов или почти без разрывов,- ведущей цепью. И фрагменты Оказаки, и ведущая цепь синтезируются в направлении 5'—>3'. Прерывистая сборка отстающей цепи позволяет путем полимеризации в направлении 5—>3' на атомном уровне получать общий рост цепи в направлении 3'—>5'.

Механизм репликации ДНК E.coli: 1) Особая РНК-полимераза (праймаза), кот. не нуждается в затравке синтез-ет корот. цепь РНК от 10 до 200 пар нуклеотидов, комплементарную одной из цепи ДНК-матрицы.

2) 3'-ОН группа концевого рибонуклеотида этой цепи РНК служит затравкой для синтеза ДНК под действием голофермента ДНК-полимеразы III.

3) РНК-компонент этого РНК-ДНК-гибрида гидролизуется под действием ДНК-полимеразы I.

4) После удаления РНК из новообразованных цепей между фрагментами ДНК остаются бреши. ДНКполимераза I, которая хорошо приспособлена для синтеза ДНК на одноцепочечной матрице, заполняет эти бреши.

Действию праймазы предшествует образование предзатравочного промежуточного комплекса, состоящего как минимум из пяти белков. Один из них - белок dnaB - может передвигаться вдоль ДНК, используя энергию гидролиза АТР. Белок dnaB может служить сигналом для активации праймазы. Специфичность инициации очередного цикла репликации может обеспечиваться белками, доставляющими белок dnaB точно в область гена ilv, где находится точка начала репликации хромосомы E.coli. Время начала репликации ДНК должно быть скоординировано с делением клетки. И действительно, бактериальная хромосома ассоциирована с впячиванием клеточной мембраны.

Две репликационных вилки движутся в противопол. направлении со скоростью 500 нуклеотидов/с, пока не закончится репликация кольцевой ДНК. Они удваивают геном за 40 минут.