Существует два метода химической фиксации мазков:

1. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в банку с фиксатором, высушивают на воздухе и микроскопируют.

2. На горизонтально установленные предметные стекла с мазками наносят по капле фиксатор и дают высохнуть.

Время фиксации зависит от применяемых в качестве фиксаторов веществ.

ОРИЕНТИРОВОЧНАЯ ОКРАСКА БАКТЕРИЙ ПРОСТЫМИ МЕТОДАМИ

Окраска выявляет морфологию и частично структуру клетки.

Для простой окраски используют только один краситель, чаще всего красного цвета – раствор фуксина (окраска 10 – 30 сек), фиолетового – генцианвиолет (окраска производится в течение 1 – 2 мин) или синего – метиленовый синий (окраска в течение 3 – 5 мин), далее препараты промывают водой и высушивают на воздухе.

При окраске мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной Синевым А.И. Для этого на высушенный и фиксированный препарат кладут красящую бумагу размером 2х4 см и наносят несколько капель воды. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу снимают пинцетом, мазок промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Микроскопия препарата с иммерсионным объективом

Иммерсионный объектив даёт увеличение х90 при условии отсутствия рассеивания потока лучей в связи с неоднородностью среды при их прохождении. В этой связи, во избежание такого дефекта применяется иммерсионное кедровое масло или его заменитель - вазелиновое масло. Процесс микроскопии с иммерсионным объективом х90 ведут с окулярами х7, х10, но чаще с первым из них.

Переносить микроскоп необходимо двумя руками: одной держать штатив, другой – основание микроскопа. Следует предохранять микроскоп от толчков, соприкосновения с сильнодействующими веществами типа кислот, щелочей.

Техника микроскопии состоит из нескольких этапов:

1. На готовый окрашенный мазок наносят каплю масла.

2. Под контролем глаза сбоку осторожно опускают тубус, погружая объектив в каплю масла. При неосторожном выполнении можно раздавить либо линзу объектива, либо предметное стекло.

3. После прикосновения объектива к маслу дальнейшее опускание тубуса ведётся с помощью микровинта микроскопа до появления микрообъектов в окуляре.

4. Просмотр препарата ведут только за счёт манипуляций с микровинтом и движения стекла.

5. После окончания микроскопии тубус поднимают, объектив выходит из капли масла.

6. Масло с объектива удаляют чистой марлей и протирают жирорастворителем - либо ксилолом, либо спиртом, либо хлороформом. Оставлять масло на линзе объектива нельзя.

7. Револьверную часть на тубусе устанавливают на объектив х8, конденсор и тубус опускают, переводя в нерабочее состояние, и закрывают микроскоп колпаком.

Изучение тинкториальных свойств бактерий по методу грама

Техника окраски:

1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым раствором генцианового фиолетового в течение 1-2 минут.

2. Сливают остаток краски, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.

3. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96⁰ спиртом (препарат несколько раз помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек). Обесцвечивание проводят не более 20 – 30 сек.

4. Препарат промывают водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина 1 - 2 минуты.

6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Оценка результатов. Грамположительные бактерии окрашены в темно-фиолетовый или синий цвет, грамотрицательные – в красный или розовый.

ОКРАСКА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ МИКРОБОВ М. TUBERCULOSIS

МЕТОДОМ ЦИЛЬ – НИЛЬСЕНА

Техника окраски:

1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, не превышающий по размеру предметное стекло.

2. Наливают карболовый фуксин Циля (основной краситель) и осторожно нагревают мазок на горелке/спиртовке 3-5 минут до появления паров, после чего оставляют краситель, пока препарат несколько остынет.

3. Снять бумагу с фуксином и промыть препарат водой.

4. Окрашенный препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) 3-5 сек или смесью 10 частей спирта и 1 части соляной кислоты в течение 1-2 мин или 95 % этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты (HCl), несколько раз погружая предметное стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом, пока мазок на вид не станет бледно-розовый.

5. Препарат тщательно промыть водой.

6. Споласкивают его 96% этиловым спиртом (в лаборатории часто этот этап упускают).

7. Снова ополаскивают водой.

8. Докрашивают 3-5 мин водным раствором метиленового синего Леффлера (дополнительный краситель).

7. Препарат промыть водой, подсушить и микроскопировать.

Оценка результатов. Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые – в сине-голубой.