Микроскоп или оптическое устройство	Особенность и сущность	Разрешающая способность	Назначение
Световой микроскоп (МБИ - 1, 2, 3, 6, 11)	Все объекты рассматриваются в проходящем свете сухим и иммерсионным объективом	Разрешающая способность - 0,4-0,2 мкм. Увеличение при данной длине тубуса равно произведению увеличений объектива и окуляра. Минимальное - 630 (для иммерсионного объектива) и максимальное – 1350	Используется для изучения морфологии, структуры, подвижности и тинкториальных свойств микроорганизмов
Люминесцентный микроскоп	Использование ультрафиолетовых лучей и люминесциру-ющих красителей, способных светиться (флю-оресцировать) под УФ - лучами. Позволяет наблюдать микроорганизмы в излучаемом ими свете и цвете	Разрешающая способность - 0.1 мкм. Повышение её связано с использованием коротковолновых ультрафиолетовых лучей. Максимальное увеличение - в 3000 раз. Преимущество - цветное изображение, высокая контрастность, возможность исследовать живые объекты	Используется не только для изучения морфологии, и тинкториальных свойств, но и для исследования процессов жизнедеятельности микробной клетки
Электронный микроскоп	Принцип действия и устройства подобен таковым у обычного светового микроскопа. Различия - вместо источника света – источник электроволн (вольфрамовая проволока, нагреваемая электротоком, вместо оптических линз - электромагнитные)	Разрешающая - способность 0.001 мкм. Первое промежуточное увеличение в 130 раз, от проекционной линзы - в 20 - 200 раз, в целом - 2500-25 000, максимум – в 100 000 раз	Широко используется для изучения вирусов, мельчайших микроорганизмов. В бактериологии используется для изучения деталей тонкого строения
Инвертированные микроскопы (тёмнопольный, фазово-контрастный)	Исследования проводят в проходящем свете в светлом или тёмном поле с применение метода фазового контраста. МБИ - 12,13 снабжены собственными столиками-термостатами, кинокамерами. Линзы окуляра и объектива дают обратное увеличенное изображение	Позволяет проводить широкий круг микроскопических исследований, визуальное наблюдение, фотографирование, применение светлого и тёмного полей в прямом и отражённом свете, прямое и косое освещение, микроскопирование в поляризованном свете, методом фазовых контрастов, в свете люминесценции. Методы наблюдения в темном поле, фазово-контрастный используется с целью исследования живых клеток микроорганизмов
Стереомикроскоп	Даёт подсвет в прямом и косопроходящем свете	Наиболее пригоден для крупных объектов (грибов)	Изучение колоний, микологических культур

ОБЕЗЖИРИВАНИЕ СТЁКОЛ проводят одним из приведённых способов:

1) Новые стёкла кипятят 15 минут в 1 % растворе соды (или в мыльной воде), затем промывают водой, кладут в слабый раствор соляной кислоты, вновь тщательно промывают водой.

2) Стёкла, бывшие в употреблении, сначала помещают в концентрированную серную кислоту или в смесь из 100 частей серной кислоты и 50 частей двухромовокислого калия и 1000 частей воды на 2 часа, после чего кипятят в щёлочи, тщательно промывают водой.

3) Погрузить стёкла в смесь 6 % хромовокислого калия и серной кислоты на 24 часа, после чего тщательно промывают водой. Хранят стёкла в 96 % растворе спирта.

4) Стекла можно также обрабатывать жидкостью следующего состава (по Цеттнову (Zettnow), 1899): Kalii bichromici - 20 г, Acidi sulfuric crudi – 20 г, воды – 200,0 мл. После 10 минут кипячения в этой смеси промывают стекло 5 минут в слабом растворе щелочи, а затем промывают водой и, наконец, спиртом.

Перед работой стёкла протереть кусочком сухого мыла, затем тщательно до блеска протереть кусочком марли.

Для продолжительного хранения чистые обезжиренные стекла помещают в банки с притертыми пробками со смесью Никифорова (смесь равных объемов этилового 96% спирта и серно-кислого (наркозного) эфира) или в 96⁰ спирте или промытыми и вытертыми досуха.

Оценка результата. На чистом стекле капля водопроводной воды или изотонического раствора натрия хлорида (NaCl) свободно растекается по всей поверхности, на жирном – дробится на множество мелких капель.

Приготовление и окраска микропрепаратов:

1. Подготовить для микроскопии 4 предметных стекла:

- обезжирить предметные стёкла, тщательно протерев их мылом и марлей;

- стёкла с помощью пинцета внести в пламя спиртовки, прогреть, охладить;

- тщательно протереть сухим ватным тампоном.

2. Приготовить 3 мазка из микробов, выросших на жидкой среде (обратить внимание на правильное положение рук: правой - держащей пробирку с ростом микробов в МПБ и левой - бактериальную петлю и ватную пробку);

- обжечь петлю в пламени спиртовки;

- охладить;

- открыть пробку пробирки левой рукой (мизинцем), обжечь её края над пламенем спиртовки;

- внести в МПБ петлю, взять 1 каплю культуры;

- обжечь края пробирки, пробку, закрыть пробирку, поставив её в штатив (не выпуская из правой руки петлю с материалом);

- обезжиренное, обожжённое в пламени спиртовки и охлаждённое предметное стекло взять большим и указательным пальцами в левую руку;

- петлёй материал нанести на стекло, равномерно растирая круговыми движениями по поверхности в виде круга;

- препарат высушить на воздухе и затем фиксировать методом фламбирования или прогрева, трижды внося в пламя спиртовки, охладить;

- пипеткой налить на мазок 3-4 капли красителя (метиленовый синий) на 3-4 мин.;

- промыть препарат водой, высушить на воздухе. Мазок готов для микроскопии:

3. Приготовить мазок из микробной культуры, выросшей на плотной среде - МПА:

- на обезжиренное стекло нанести каплю воды или физиологического раствора;

- с поверхности среды (обратить внимание на правильность положения пробирки с ростом скошенной поверхностью кверху), петлёй осторожно взять материал;

- обжечь края пробирки, пробку закрыть, поставить в штатив, не выпуская из рук петлю с культурой;

- внести материал петлёй в каплю воды на предметном стекле, равномерно растереть, на стекле с обратной стороны обозначить овалом или квадратом место нанесения материала;

- высушить на воздухе;

- фиксировать фламбированием, внося в пламя спиртовки трижды, охладить.

Способы фиксации мазков из микробов и смешанного материала

Самым распространённым методом фиксации бактерий считается обработка жаром, что осуществляется путём трёхкратного проведения препарата мазком вверх над пламенем спиртовки или газовой горелки. Препарат находится в пламени спиртовки не более 3 сек. Для проверки надежности фиксации свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной стороне левой кисти. При правильном фиксировании стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущений ожога. После чего препараты из бактерий окрашиваются разными способами. Метод применим при работе с чистой культурой микробов.

Фиксация химическими веществами используется для выявления и дифференциации структурных элементов: жгутиков, протоплазмы, нуклеоида, оболочки, при работе со смешанным материалом (кровь, отпечатки органов, соскобы со слизистых, гной, мокрота).

В качестве фиксаторов используют:

- метиловый спирт (фиксируют 5 минут),

- этиловый спирт 96% (фиксируют 10 - 20 минут),

- смесь Никифорова: равные объёмы спирта и эфира (фиксируют 10 - 20 минут),

- спирт - формол: смесь 5мл неразведённого формалина мл и 96 % этилового спирта – 95 мл (фиксируют 15 минут),

- жидкость Буэна (Bouin, 1898): неразбавленный формалин 10 мл, ледяная уксусная кислота 2 мл, насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 30 мл (фиксируют 5 - 10 минут),

- ацетон (фиксируют 5 минут),

- жидкость Карнуа (Karnoy) - ледяная уксусная кислота 10 мл, хлороформ 30 мл и 96 % спирт 60 мл (фиксируют 10-15 минут). Жидкость Карнуа является прекрасным фиксатором, в особенности для изучения тонкого строения бактерий. Жидкость Карнуа нельзя применять для фиксации мазков крови и отпечатков внутренних органов, так как она вызывает полный гемолиз эритроцитов.