Самостійна робота № 1

Тема: Види мікроскопів та їх використання при мікроскопічному дослідженні мікроорганізмів.

Актуальність. Мікроскопи використовуються при мікроскопічному методі дослідження. Він є простим і економічним, дає змогу швидко виявити характерні морфологічні особливості збудника й має важливе значення при діагностиці гонореї, менінгококового менінгіту, туберкульозу, лепри, поворотного тифу, віспи, малярії, лейшманіозу, токсоплазмозу тощо.

Контрольні питання.

1. Мікроскопічний метод дослідження та його суть.

2. Будова світлового мікроскопа.

3. Імерсійна світлова мікроскопія. Роздільна здатність об'єктива.

4. Фазо-контрастна мікроскопія.

5. Аноптральна мікроскопія.

6. Інтерференційна мікроскопія.

7. Поляризаційна мікроскопія.

8. Мікроскопія в темному полі.

9. Люмінесцентна мікроскопія.

10. Конфокальна лазерна скануюча мікроскопія.

11. Електронна мікроскопія.

12. Переваги та недоліки мікроскопічного методу дослідження.

Тестові завдання.

1.При фазо-контрастній мікроскопії нативного матеріалу мікробні клітини виглядають:

А. Світлими D. Не забарвленими

В. Темними Е. Частково забарвленими

С. Забарвленими

2. За допомогою фазо-контрастної мікроскопії нативних мазків виявляють (більше, ніж одна відповідь):

А. Структурні елементи живих бактерій

В. Структурні елементи забарвлених бактерій

С. Стадії розвитку живих бактерій

D. Зміни в живій клітині під впливом хімічних речовин

Е. Стадії розвитку бактерій в забарвленому мазку

3 Мікроскопія в темному полі використовується переважно для:

А. Вивчення структури бактерій

В. Вивчення забарвлених препаратів

С. Вивчення рухливості мікроорганізмів

D. Вивчення проникності мембран

Е. Вивчення активності ферментів

4. Аноптральна мікроскопія використовується для (більше, ніж одна відповідь):

А. Дослідження забарвлених мазків

В. Прижиттєвого дослідження бактерій

С. Прижиттєвого дослідження найпростіших

D. Дослідження вірусів

Е. Дослідження грибів

5. Інтерференційна мікроскопія використовується для (більше, ніж одна відповідь):

А. Дослідження проникності мембран

В. Дослідження активності ферментів

С. Дослідження клітинного метаболізму

D. Дослідження деталей зафарбованого об’єкту

Е. Дослідження прозорого об’єкту

Література.

1. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 10-18.

2. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011.- С.54-77.

Самостійна робота 2.

Тема: Роль вітчизняних вчених у розвитку мікробіології.

Актуальність. Вітчизняні мікробіологи стояли біля витоків створення мікробіологічної науки, працювали разом з геніальним Л.Пастером, закладали її фундамент. Вони долучилися до значних відкрить та практичних розробок, які позитивно вплинули на інфекційну захворюваність у світі.

Контрольні питання.

1. Видатні вчені - мікробіологи України: Гамалія Н.Ф., Здродовський П.Ф., Л.А.Тарасевич, Савченко І.Г., Дроботько В.Г., Виноградський С.Н., Нещадименко М.П.

2. Внесок Заболотного Д.К. у розвиток вітчизняної мікробіології.

3. Галицька мікробіологічна школа (Р. Вейгль, Г.С.Мосінг).

4. Кафедра мікробіології Львівського національного медичного університету (Н. Гонсьоровський, М.М.Музика, Л.Чорна).

Тестові завдання.

1.Першу кафедру мікробіології (у Петербурзі) було створено:

А. Гамалією М .Ф.

В. Заболотним Д.К.

С. Івановським Д.І.

D. Зільбером Л.А.

Е. Тереховський М.М.

2. Наукова діяльність Івановського Д.І. пов’язана з:

А.Створенням першого мікроскопа

В. Відкриттям вірусів

С.Відкриттям явища фагоцитозу

D. Отриманням антирабічної вакцини

Е.Відкриттям явища трансформації

3. Назвіть ім’я вченого, який є автором вчення про десенсибілізацію, був учнем І.І.Мечникова і працював в інституті Л.Пастера:

А. Флемінг О. D. Тарасевич Л.А.

В. Савченко І.Г. Е. Габричевський Г.М.

С. Безредка А.М.

4. Назвіть прізвище лауреата Нобелівської премії за досягнення у галузі імунології:

А. Мечников І.І.

В. Габричевський Г.Н.

С. Ісаєв В.І.

D. Єрмолаєва З.В.

Е. Тарасович Л.А.

5. Засновником мікробіології ґрунту вважають:

А. Здродовського П.Ф.

В. Омелянського В.Л.

С. Заболотного Д.К.

D. Виноградського С.М.

Е. Красильникова М.А.

Література:

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.,2001. – C.11-15.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.30-36.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. Київ, Медицина, 2009. - С.20-21.

4. До історії розвитку мікробіології у науково-дослідних і навчальних закладах України (під редакцією акад. НАНУ В.П.Широбокова). – Київ:Книга плюс. - 2006.- 299 с.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – С.-П., 2002. – С. 7-14.

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011.С. 40-54.

Заняття 2.

Тема: Мікроскопічний метод дослідження. Ультраструктура бактеріальної клітини. Складні методи фарбування. Методи Грама, Циля-Нільсена.

Актуальність. Складні методи фарбування потребують використання декількох різноманітних барвників, які дозволяють виявити особливості будови або хімічного складу бактерій. Форма бактерій, їх структура і особливості забарвлення (тинкторіальні властивості) є важливими критеріями для ідентифікації бактерій.

Мета і завдання. Оволодіння складними методами фарбування бактерій і вивчення структури бактеріальної клітини. Вивчення особливостей ультраструктури прокаріотичних клітин, морфологічних і тинкторіальних критеріїв ідентифікації бактерій.

Контрольні питання.

1. Значення складних методів фарбування бактерій.

2. Барвники, що використовуються для фарбування за методом Грама.

3. Послідовність фарбування за методом Грама, практичне значення методу.

4. Будова прокаріотичної клітини, відмінності від будови еукаріотичної клітини.

5. Будова клітинної стінки грампозитивних бактерій.

6. Будова клітинної стінки грамнегативних бактерій.

7. Протопласти, сферопласти та L - форми.

8. Особливості хімічного складу кислотостійких мікроорганізмів.

9. Практичне значення методу Циля-Нільсена. Послідовність фарбування.

Практичні навики.

1. Вивчити етапи і послідовність фарбування за методом Грама.

2. Засвоїти ознаки диференціації грам позитивних і грам негативних бактерій.

3. Оволодіти методикою фарбування за методом Циля-Нільсена.

Тестові завдання.

1. Протопластами називаються клітини (більше, ніж одна відповідь):

А. В яких відсутня клітинна стінка

В. В яких частково відсутня клітинна стінка

С. Які характеризуються поліморфізмом

D. Які проходять через бактерійні фільтри

Е. Які містять хлоропласти

2. Під час фарбування за Грамом у грам позитивних бактерій відбувається:

А.Забарвлення в колір додаткової фарби - фуксину

В.Вимивання основного барвника спиртом

С.Взаємодія генціанвіолету з ліпополісахаридами клітинної стінки

D.Забарвлення метиленовим синім

E.Утворення спиртостійкого комплексу генціанвіолет-йод

3. Вкажіть правильну послідовність фарбування за методом Ціля-Нільсена: 1. Підігрівання препарату з нанесеним барвником. 2. Промивання препарату водою. 3. Знебарвлення препарату 5% сірчаною кислотою. 4. Нанесення на препарат карболового фуксину. 5. Фарбування препарату метиленовою синькою.

А. 5,1,3,2,4

В. 4,2,3,1,5

С. 4,1,3,2,5

D. 5,4,3,1,2

Е. 1,4,5,2,3

4. Які з означених компонентів входять до складу клітинної стінки грам позитивних бактерій (більше 1 правильної відповіді)?

А. Ліпополісахариди

В. Пептидоглікан

С. Тейхоєві кислоти

D. N-ацетилмурамова кислота

Е. Високомолекулярні ліпіди

5. Вкажіть правильну послідовність використання барвників при забарвленні за Грамом. 1. Алкоголь 96° 2. Алкоголь-водний фуксин 3. Вода для промивання 4. Генціанвіолет 5. Розчин йоду в йодистому калії.

А. 4,1,5,3,2

В. 2,4,5,1,3

С. 2,5,3,4,1

D. 4,1,2,5,3

Е. 4,5,1,3,2

Приклади тестів «Крок 1».

1. У баклабораторії під час мікроскопії мазків з харкотиння хворого на хронічне легеневе захворювання, забарвлених за Цилем-Нільсеном, виявлені червоні палички. Яка властивість туберкульозної палички виявлена при цьому?

A. Кислотостійкість

B. Спороутворення

C. Лугостійкість

D. Капсулоутворення

Е. Спиртостійкість

Ситуаційна задача.

У тварини – скелет, у комахи – хітиновий панцир, у рослини – целюлоза, у бактерії – ? А. Яка структура забезпечує ригідність бактеріальної клітини? В. Який її хімічний склад, будова та метод виявлення? C.Значення методу в медичній мікробіології.

Зміст і хід заняття:

Робота 1. Дослідження морфологічних та тинкторіальних властивостей культури бактерій за допомогою методу Грама (модифікація Синьова).

Принцип методу. Компоненти клітинної сінки грампозитивних бактерій, яка містить багато шарів пептидоглікану і тейхоєву кислоту, створюють стійкий комплекс з йодом та генціанвіолетом, що не вимивається спиртом і тому вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. Клітинні стінка грам негативних бактерій має меншу товщину та інший хімічний склад, і тому цей комплекс вимивається спиртом. На останньому етапі фарбування такі бактерії забарвлюються фуксином в рожевий колір.

Хід роботи: приготувати препарат-мазок із суміші бактерій, зафіксувати на полум'ї пальника. На зафіксований мазок покласти фільтрувальний папір з генціанвіолетовим, нанести на нього декілька крапель дистильованої води, фарбувати 2 хв., зняти папірець і на мазок нанести розчин Люголя на 1 хв., злити розчин і знебарвити мазок 96° спиртом (30 сек.), промити водою і дофарбувати алкоголь-водним розчином фуксину (2 хв.), знову промити водою, висушити фільтрувальним папером і мікроскопувати в імерсійній системі мікроскопа. Описати препарат і зробити висновок про інформативність методу Грама.

Практичне значення. Метод дозволяє диференціювати бактерії на грампозитивні і грамнегативні, що використовується при мікробіологічній діагностиці інфекційних захворювань, і в залежності від виділення тих чи інших раціонально призначати лікування антибіотиками та хіміопрепаратами.

Робота 2. Скласти таблицю “Будова клітинної стінки у бактерій” за наступною схемою:

	ГРАМ+	ГРАМ-
Товщина
Ліпіди (%)
Пептидоглікан (%)
Тейхоєві кислоти

Робота 3. Дослідження препарату, пофарбованого за методом Циля-Нільсена.

Принцип методу. Клітинна стінка кислотостійких бактерій містить багато жирів, восків, ліпідів і тому після фарбування концентрованим фуксином Циля міцно утримує його і не знебарвлюється сірчаною кислотою, решта бактерій знебарвлюються і профарбовуються на останньому етапі метиленовим синім.

Хід роботи: на зафіксований мазок покласти фільтрувальний папір і нанести на нього декілька крапель карболового фуксину Циля, підігріти над полум'ям пальника до появи пари, охолодити, повторити нагрівання і охолодження ще двічі. Зняти папірець і занурити мазок у 5% сірчану кислоту для знебарвлення на 20 сек. Промити водою і дофарбувати метиленовим синім впродовж 5 хв., знову промити водою, висушити.

При мікроскопії з імерсійною системою видно кислотостійкі рубіново-червоні тонкі, ніжні, трохи зігнуті палички, що розміщені поодиноко або групами і кислотонестійкі елементи синього кольору, що складають основний фон препарату — еластичні волокна, слиз, кокоподібні та паличкоподібні бактерії.

Практичне значення. Метод дозволяє диференціювати бактерії на кислотостійкі і кислотонестійкі. До кислотостійких бактерій відносяться такі мікроорганізми, як збудники туберкульозу, мікобактеріозів та прокази.

Складання протоколів. Описати хід фарбування за методом Грама (завдання 1), Циля-Нільсена (завдання 3). Замалювати і описати мікроскопічну картину препаратів (завдання 1, 3). Заповнити таблицю (завдання 2).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С. 32-40.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.36-42.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.31-39.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 32-45.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П., 2002.-С.33-39.

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця, “Нова книга”. – 2011. С.64-77.

Заняття 3.

Тема: Мікроскопічний метод дослідження (продовження). Негативні методи фарбування. Ультраструктура бактеріальної клітини.

Актуальність. Спеціальні методи фарбування, при яких використовують декілька різноманітних барвників дозволяє виявити окремі структурні елементи бактеріальної клітини, що є важливим при визначенні виду мікроорганізму, його ідентифікації.

Мета і завдання. Оволодіння складними методами фарбування бактерій і вивчення структури бактеріальної клітини. Вивчення особливостей ультраструктури прокаріотичних клітин, морфологічних і тинкторіальних критеріїв ідентифікації бактерій.

Контрольні питання.

1. Значення складних методів фарбування при дослідженні бактерій.

2. Будова оболонки бактеріальної клітини.

3. Особливості будови нуклеоїда, рибосом у бактерій.

4. Капсули, спори. Функціональне значення, методи виявлення.

5. Джгутики, включення бактеріальної клітини. Функціональне значення, методи виявлення.

6. Практичне значення дослідження живих мікроорганізмів.

Практичні навики.

1. Оволодіти методикою негативного фарбування.

2. Оволодіти методикою виявлення структур бактеріальної клітини в препаратах.

3. Оволодіти методикою дослідження живих мікроорганізмів.

Тестові завдання.

1. Які методи дослідження дозволяють виявити джгутики у бактеріальній клітині?

А. Імпрегнація сріблом

В. Електронна мікроскопія

С. Роздавлена крапля

D. Висяча крапля

Е. Всі відповіді правильні

2. Клітини, в яких відсутня клітинна стінка, називаються:

А. L- формами

В. Прокаріотами

С. К-формами

D. Еукаріотами

Е. Мікоплазми

3. До поверхневих структур бактеріальної клітини належать:

А. Капсула, джгутики, ворсинки

В. Клітинна стінка, капсула, цитоплазматична мембрана

С. Клітинна стінка, цитоплазматична мембрана, капсула

D. Клітинна оболонка, цитоплазма

Е. Капсула, клітинна стінка, ворсинки

4. Яка функція бактеріальної спори?

А. Репродуктивна

В. Збереження виду

С. Захист мікроорганізму

D. Синтез білка

Е. Поділ бактеріальної клітини

5. Вкажіть основну функцію бактеріальної капсули у бактерій, що викликають інфекційні хвороби?

А. Транспорт речовин в клітину

В. Протистояння фагоцитозу

С. Забезпечення стійкості до антимікробних речовин

D. Забезпечення стійкості до дії кислот

Е. Зумовлюють форму бактеріальної клітини

Приклади тестів «Крок 1» .

1.При мікроскопії мікробної культури виявлено спороутворюючі мікроорганізми, які мають форму веретена і за Грамом фарбуються у синьо-фіолетовий колір. Що це за мікроорганізми?

А. *Клостридії D. Актиноміцети

В. Стрептококи Е. Диплококи

С. Спірохети

2. В препараті, зафарбованому за методом Ожешки видно паличкоподібні мікроорганізми, зафарбовані в синій колір, в яких термінально розміщені компоненти круглої форми, зафарбовані в червоний колір. Як називаються ці компоненти?

A.* Спори

B. Війки

C. Джгутики

D. Капсули

E. Мезосоми

3.В бактеріологічну лабораторію доставлені блювотні маси хворого з підозрою на холеру. Із патологічного матеріалу приготовано препарат “висяча крапля”. Який метод мікроскопії буде використаний для виявлення збудника за його рухливістю?

А. *Фазово-контрастна D. Люмінесцентна

В. Електронна Е. Імерсійна

С. Імунна електронна

Ситуаційна задача.

Для приготування мазка з агарової культури мікроорганізмів студент наніс краплю фізіологічного розчину на предметне скельце, вніс туди петлю культури, і для прискорення процесу висушування мазка, пропалив скельце над полум'ям пальника. А. Оцініть правильність дій студента. В. Які помилки допущено?

Зміст і хід заняття:

Робота 1. Негативний метод фарбування.

Хід роботи. На край предметного скла нанести краплю фарби конго-рот, петлею внести культуру стафілокока, розтягнути суміш фарби з мікробами шліфованим склом по всій поверхні предметного скла. Мазок висушити на повітрі і розглянути з допомогою імерсійної системи мікроскопа.

Мікроскопічна картина: на червоному фоні видно безколірні коки, розташовані гронами, що нагадують виноградні грона.

Практичне значення. За допомогою цього методу можна вивчати морфологію бактерій.

Робота 2. Виявлення спор у бактерій:а) негативний метод виявлення спор.

Принцип методу. Спора бактеріальний клітин має властивість заломлювати світло в такий спосіб, що вони при світловій мікроскопії є незабарвленими.

Виявити спори в препараті-мазку з культури антракоїда, зафарбованому за Грамом. Мікроскопічна картина: видно великі грампозитивні стрептобацили. В окремих паличках - незабарвлені, розміщені центрально овальні спори;

6) виявлення спор за методом Ожешки.

Принцип методу. Спора бактерій є кислотостійким утвором і тому фарбуються в такий самий колір як і кислотостійкі бактерії. Виявити спори в препараті-мазку з культур антракоїда, зафарбованому за методом Ожешки. Мікроскопічна картина: видно сині палички в деяких з них великі овальні термінальні спори, забарвлені в червоний колір, а також спори, розміщені позаклітинно.

Практичне значення. Спора є важливою видовою ознакою мікроорганізмів. Виділення спорових бактерій з клінічного матеріалу потребує особливих протиепідемічних заходів при роботі з такими культурами та в осередку інфекції а також планування відповідних заходів профілактики та лікування.

Робота 3. Виявлення включень у бактеріях у препаратах, зафарбованих за методом Нейсера.

В принципу методу покладено феномен метахромазії, коли включення фарбуються у колір відмінний від кольору основного барвника.

Хід роботи. На зафіксований мазок нанести 2-3 краплі оцтово-кислого синього на 1 хв., промити водою. Нанести розчин люголя на 20- 30 сек., не промиваючи водою, зафарбувати хризоїдином 10- 15 сек., промити водою і після висушування мікроскопувати за допомогою імерсійної системи. Мікроскопічна картина: видно середніх розмірів палички, розташовані під кутом, світло-коричневого кольору з темно-синіми, майже чорними зернами волютину, розташованими бітермінально.

Практичне значення. Виявлення біполярних включень у коринебактерій бактерій дозволяє деференціювати збудника дифтерії від непатогенних коринебактерій.

Робота 4. Виявлення капсул у бактерій за методом Дроботька.

Принцип методу. Капсула бактерій за звичайних умов погано сприймає анілінові барвники і тому виглядає безколірною.

Хід роботи. На край предметного скла нанести краплю фарби конго-рот. Петлею внести бактеріальну культуру, розмішати і шліфованим склом зробити мазок по всій поверхні предметного скельця. Мазок висушити на повітрі і нанести тонким шаром кислий фуксин, приготований на кислому спирті. Після висушування мазок мікроскопують за допомогою імерсійного об’єктиву.

Мікроскопічна картина: на червоному фоні видно рожеві палички, оточені безколірною широкою капсулою.

Практичне значення. Виявлення капсул допомагає встановити вид збудника і свідчить про високу вірулентність бактерій.

Робота 5. Розміщення і структура джгутиків, війок.

Хід роботи. Вивчення джгутиків і війок бактерій за допомогою електронних мікрофотографій; ознайомлення з молекулярною структурою джгутиків за схемами і таблицями.

Робота 6. Дослідження живих мікроорганізмів, приготування препарату”роздавлена крапля”.

Принцип методу. Прижиттєве мікроскопічне вивчення дозволяє побачити рух мікроорганізмів.

Хід роботи: на предметне скло пастерівською піпеткою нанести краплю сінного настою при температурі 37°С. Обережно накрити покривним склом, на яке зверху нанести краплю імерсійної олії і розглянути з допомогою імерсійного об'єктиву мікроскопа при опущеному конденсорі та звуженій діафрагмі. Мікроскопічна картина: на сірому фоні видно активний рух бактерій у полі зору.

Практичне значення. Метод дозволяє в непрямий спосіб довести наявність у бактерій органів руху, що може бути використане при їх ідентифікації.

Складання протоколів. Замалювати і описати мікроскопічну картину препаратів

(роботи 1- 6).

Література.

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. - М., 2005.-С. 26-32.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.30-36.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.28-51.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 5-32.

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.64-77.