5. Ферментные препараты, выделенные из микроорганизмов: свойства, технология получения

Большую часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят на основе культивирования бацилл (пре­жде всего, В. subtilis),микроскопических грибов родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma,а также актиномицетов родов Actinomyces, Streptomyces.Чаще всего используют мезофильные штаммы аэробных микроорганизмов.

К микроорганизмам – продуцентам ферментов предъявляются следующие требования:

1. Наличие высокой ферментативной активности. Среди микроорганизмов, обладающих высокой активностью определенного фермента, предпочтение отдается тем, которые в оптимальных физиологических условиях способны синтезировать преимущественно один фермент или группу родственных ферментов (например, только а-амилазу или только комплекс целлюлаз).

2. Важнейшим качеством продуцента фермента является его генетическая ста­бильность, которая выражается в способности сохранять на протяжении многих поколений определенный уровень биосинтеза фермента в соответствующих усло­виях.

3. К чисто технологическим характеристикам продуцентов ферментов следует отнести их скорость роста, устойчивость к инфекции, отношение к источникам питания и другим внешним факторам.

Преобладающим способом культивирования микроорганизмов является глу­бинный, основанный на выращивании продуцентов в стерильных жидких средах с принудительной аэрацией (для аэробных форм) и перемешиванием среды, при автоматическом регулировании параметров процесса, таких как температура, рН среды, ее окислительно-восстановительный потенциал, концентрация растворен­ного кислорода и пр.

Применяется поверхностный способ культивирования, когда культуры продуцентов выращивают на поверхности жидких и сыпучих (твердофазное культивирование) питательных сред (отруби, свекловичный жом, измельченное целлюлозосодержащее сырье, солодовые ростки и др. Приоритет отдают твердофазному процессу, так как условия культивирова­ния продуцентов максимально приближены к естественным, в которых полно­стью реализуется биопотенциал микроорганизмов.

Препараты, выделенные из глубинной культуры, имеют в индексе букву «Г» (глубинный), из поверхностной – «П» (поверхностный). Далее следует цифро­вой индекс, который характеризует степень концентрирования фермента в препа­рате по отношению к культуральной жидкости или твердофазной культуре. Так, препараты с индексом «Г3х» должны иметь активность в ед./г в 3 раза выше, чем средняя активность культуральной жидкости в ед./мл. Устанавливается стандарт­ная активность препарата, соответствующая этому соотношению. Стандартная активность, как правило, не изменяется в течение многих лет.

Препараты, содержащие комплекс ферментов, где важно соотношение ком­понентов комплекса, характеризуются по двум или более видам активности. При этом цена устанавливается в соответствии с основной активностью, обычно явля­ющейся интегральной. Для препаратов целлюлаз – это активность, определяемая по действию на фильтровальную бумагу (так называемая активность АФБ), для пектиназ – общая пектолитическая.

Распро­странены препараты с тривиальными названиями, в которых отражены: основной вид активности, величина активности, название фирмы и т. д.

Индексом «Гх» обозначается неочищенная культуральная жидкость проду­цента фермента. В пищевых производствах препараты «Гх» пригодны лишь в технологических процессах, где исключено попадание препарата в готовый продукт, например при производстве спирта, где ферментные препараты удаляются из продукта в процес­сах отгонки и ректификации.

Препараты с индексом «Г3х» получают путем распылительной сушки концен­трированной культуральной жидкости. Концентрирование проводится методом вакуум-выпаривания при температуре, не вызывающей инактивации ферментов (обычно не выше 30 °С).

Препараты с индексом «Г3х» являются неочищенными. Они имеют высокую степень микробной обсемененности, порядка 10 ¹⁰ спор или клеток в 1 г. В пищевой промышленности препараты «ГЗх» используются так как и Гх.

Индекс «Г3х-Ф» присвоен препаратам, которые получают путем распыли­тельной сушки концентрированного фильтрата культуральной жидкости. Препа­раты «ГЗх-Ф» являются частично очищенными, так как при фильтрации из культуральной жидкости удаляется биомасса и часть балластных веществ.

Индекс «Г10х» имеют препараты, полученные путем осаждения органичес­кими растворителями из концентрированных фильтратов культуральной жидкос­ти. Перед фильтрацией культуральную жидкость обрабатывают минеральными или органическими коагулянтами, что позволяет в процессе разделения фаз осво­бодить фильтрат от биомассы микроорганизмов, балластных белков, полисахари­дов, нуклеиновых кислот. Фильтрат концентрируют вакуум-выпариванием, добавляя при необходи­мости стабилизирующие агенты.

Область применения препаратов «Г10х» охватывает различные пищевые про­изводства, отрасли легкой и химической промышленности, кормопроизводство, ветеринарию.

Препараты с индексом «Г20х» получают с применением ультрафильтра­ции — способа концентрирования, основанного на разделении веществ различ­ной молекулярной массы с помощью полупроницаемых мембран с определенным размером пор. Ультрафильтрации подвергают предварительно очищенные фер­ментные растворы, свободные от клеток микроорганизмов и взвешенных частиц.

Препараты «Г20х» применяют при производстве пищевых продуктов и на­питков, в кормопроизводстве, в составе лекарственных средств для лечения забо­леваний, связанных с ферментной недостаточностью.

Препараты с индексом «Пх» представляют собой высушенные культуры гри­бов — продуцентов ферментов, полученные при поверхностном (чаще твердо­фазном) культивировании. Препараты «Пх» сохраняют полный ферментативный комплекс продуцентов. Они неочищены и имеют высокую микробную обсемененность. Применяются аналогично препаратам «ГЗх».

Препараты с индексами «П 10х» получают из свежих или высушенных твер­дофазных культур грибов по следующей схеме: водная экстракция ферментов из культуры гриба, отделение экстракта, осаждение ферментов из экстракта этило­вым или изопропиловым спиртом, отделение ферментного осадка, суспендирование осадка в воде, добавление к суспензии стабилизаторов и наполнителей, сушка суспензии распылением.

Препараты с индексом «П 20х» получают по схеме: экстракция ферментов из твердофазной культуры, стерилизующая фильтрация экстракта, ультрафильтра­ция, стандартизация и стабилизация ультраконцентрата, сушка его распылением. Препараты применяют аналогично «Г20х».

Препараты цитолитического действия.

«Целловиридин Г20х» – комплексный препарат целлюлолитических ферментов и гемицеллюлаз из культуры Т. reesei. В состав комплекса входят: эндо-Р-1,4-глюканаза, целлобиогидролаза, целлобиаза, эндо-Р-1,3-1,4-глюканаза, Р-1,3-глюканаза. ксиланаза.

Оптимальные условия действия препарата: рН 4,5-5,5, температура 50 °С.

«Целловиридин Г3х» – комплексный препарат целлюлолитических ферментов и гемицеллюлаз из культур Т. Reesei или Т. viride. Целлюлолитическая активность составляет по группам: 1 – 100 ед./г, 2 – 75, 3 – 50 ед./г. Оптимальные условия действия: рН 4,5-5,5, температура 45-50 °С. Наполнитель – поваренная соль.

«Целлоконингин Г 10х», «Целлолигнорин П10х» — препараты целлюлазы из культур грибов Т. koningii, Т. lignornm.В ферментном комплексе присутствуют эндо- и экзо-Р-1,4-глюканазы, целлобиогидролаза, целлобиаза, ксиланаза. Стан­дартная активность целлюлазы – 50 ед/г. Оптимальные условия действия: рН 4,5-5,5, температура 50-60 °С.

Препараты гемицеллюлазного действия.

«Ксилаком» («Ксилоглюканофоетидин Г10х») – препарат цитолитических ферментов из твердофазной культуры гриба Asp. foetidus. Препарат обладает активностью ксиланазы, полигалактуроназы, пектинэстеразы, эндо-р-1,4-глюканазы, целлобиазы, кислой протеазы, хи- тиназы, Р-глюкозидазы. Стандартизуется по ксиланазной активности, которая со­ставляет по группам, ед./г: 1 – 2000, 2 – 3000, 3 – 5000.

Оптимальные условия действия «Ксилакома»: рН 4,5-5, температура 45-50 °С. Препарат стан­дартизуется поваренной солью, кукурузной мукой. Влажность препарата 13-15 %. Обсемененность спорами гриба — не более 10² спор/г, бактериальная обсемененность – не более 10⁵ колоний/г.

«Поликанесцин Г20х» – комплексный препарат гидролитических фермен­тов из культурыPen. canescens,обладающий активностью ксиланазы, Р-1,3-1,4- глюканазы, эндо-Р-1,4-глюканазы, эндо-Р-1,4-маннаназы, эндо- и экзополигалак- туроназы, кислой протеазы, Р-галактозидазы.

Препараты пектинрасщепляющего действия.

«Пектаваморин П10х» и «Пек­таваморин Г10х» (ГОСТ 18920-73) – препараты пектолитических ферментов и кислой протеазы из культуры гриба Aspergillis awamori. Ферментный комплекс включает: эндо- и экзополигалактуроназу, пектинэстеразу, ксиланазу, кислую протеазу, β-глюканазу. Оптимальные условия действия препаратов: рН 2,5-5, температура 45-52 °С. Влажность препаратов не более 13 %.

Амило- и протеолитические ферментные препараты.

«Амилосубтилин Г3х», «Амилосубтилин Г10х» — препараты а-амилазы из культуры В. subtilis.Сопут­ствующие ферменты: эндо-р-1,3-1,4-глюканаза, нейтральная металлопротеиназа. «Амилосубтилин ГЗх» (ГОСТ 23635-90) стандартизуется по амилолитической и протеолитической активности. В качестве наполнителя используется поваренная соль.

«Амилосубтилин Г10х» имеет стандартную амилолитическую активность 3000 ед./г. Оптимальные условия действия: рН 5,4-6,2, температура 55- "0 °С. Стабилизаторы – ионы кальция и других щелочноземельных металлов, ингибиторы – хелаты, тяжелые металлы. В качестве наполнителей используют поваренную соль, кукурузную муку, мел. Влажность не более 8 %- 13 %.

«Амилоризин П10х» – препарат а-амилазы из культуры гриба Asp. oryzae. Обладает также активностью протеазы, Р-глюканазы, ксиланазы. Оптимальные условия действш препарата: рН 4,7, температура 45-55 °С. Стабилизаторы – соли кальция, инги­биторы – хелаты, тяжелые металлы.

Помимо «Амилоризина», выпускаются аналогичные препараты под названи­ями «Амилопроторизин Г10х»

«Глюкаваморин Г20х» – препарат глюкоамилазы из культуры Asp. awamori Выпускается в жидком виде и в виде порошка. Активность глюкс- амилазы, а-амилазы и протеазы для жидкой формы препарата составляет соот­ветственно 1000, 15,10 ед./г. Оптимальные условия действия препарата: рН 4,5-5 температура 55-60 °С.

«Протосубтилин Г3х», «Протосубтилин Г10х» – препараты нейтральной бак­териальной металлопротеиназы из культуры В. subtilis.Сопутствующие фермен­ты: эндо-Р-1,3-1,4-глюканаза, ксиланаза, а-амилаза. Препарат «Протосубтилин ГЗх» выпускают с активностью 70 и 100 ед./г. Стандартная активность протеазы в препарате «Протосубтилин Г10х» по группам, ед./г: 1 – 230, 2 – 180, 3 – 90, 4 – 70. Оптимальные условия действия: рН 7-7,5, температура 50 °С. Стабилиза­торы – ионы цинка и кальция, ингибиторы – хелаты, тяжелые металлы.

«Кислая протеаза Г10х» – препарат кислой протеазы из культуры гриба Asp. foetidus.Стандартная протеолитическая активность – 30 ед./г. Оптимальные условия действия: рН 2,5-3, температура 50 °С. Зона стабильности рН 2,5-6.

Препараты гидролаз олигосахаридов

«Лактоканесцин Г20х» – препа­рат Р-галактозидазы из культуры гриба Pen. canescens.Сопутствующий фер­мент – β-фруктофуранозидаза. Стандартная активность препарата – 1000 ед./г. За единицу активности Р-галактозидазы принимается такое количество фермента, которое за 1 мин при температуре 30 °С гидролизует 1 мкмоль субстрата (о-нитро- фенилгалактопиранозида) при оптимальном рН. Оптимальные условия действия препарата: рН 4-5, температура 50-60 °С.

«Галактосил» – иммобилизованный препарат β-галактозидазы из той же культуры (гриба Pen. canescens).

Препараты изомераз сахаров

«Имфрузим» – препарат глюкозоизомеразы из глубинной культуры актиномицетаAct. albogriseolus,получаемый путем иммо­билизации клеток продуцента в желатине, с последующей сшивкой глутаровым альдегидом. Оптимальные условия действия: рН 6,5-10, температура 85-90 °С. При длительной эксплуатации препарата рекомендуется рН 7,2-8, температура 63-67 °С, концентрация ионов магния в субстрате не менее 0,004 М.

Ферментные препараты липолитического и литического действия «Липоризин Г3х» – препарат липазы из глубинной культуры гриба Asp. oryzae. Оптимальные условия действия препарата: рН 6-7, температура 37 °С.

«Липоаэрузин ГЗх», «Липоаэрузин Г20х» – препараты липазы из культуры бактерииPseudomonas aeruginosa. Оптимальные условия действия: рН 7- 9,5, температура 45-50 °С.

«Лизоцим Г3х» – препарат с активностью литического фермента мурамида- зы, выделяемый из культуры В. subtilis. Оптимальные условия действия препарата: рН 6,2, температура 40 °С. Наполнитель препарата – пова­ренная соль.

«Фермосор» – иммобилизованная форма «Лизосубтилина»,

Мультиэнзимные композиции и премиксы.

«МЭК ПП-1 для пивоварения» (ТУ 59.01.003.43-81) получается путем смешения препаратов «Амилосубтилина ГЮх», «Протосубтилина Г10х» и «Амилоризина П10х» в количествах, необхо­димых для получения стандартной активности. Стандартная амилолитическая активность «МЭК ПП-1» (при рН 6) составляет по группам: 1 – 2650 ед./г, 2 – 2100 ед./г; протеолитическая активность препарата (при рН 5,5-5,7): 1 – 30 ед./г. 2 – 70 ед./г.

«Амилопротосубтилин» предназначается для использования в пивоварении при осахаривании заторов, содержащих 30^10 % несоложеного ячменя. Препарат составляют из «Амилосубтилина ГЗх-Ф» и «Протосубтилина ГЗх-Ф». Стандарти­зуется по трем видам активности. В стандартном препарате активность а-амила­зы – 600 ед./г, нейтральной протеазы – 50 ед./г, (β-глюканазы – 300 400 ед./г. Оптимальные условия действия: рН 5,5-6,5, температура 50-70 °С.

«МЭК-1 для виноделия» (ТУ 565/10.18.08-87) включает в свой состав фер­ментные препараты в следующих процентных долях: Глюканаза Г10х» с актив­ностью 600 ед./г – 50 %, «Р-Маннаназа Г10х» с активностью 300 ед./г – 3,4 %; «Кислая протеаза Г10х» с активностью 30 ед./г – 3,4 %; «Эндополигалактуроназа Г10х» с активностью 100 000 ед./г – 0,9 %. Остальные 43 % массы препара­та составляет наполнитель – поваренная соль.