Реакція зв’язування комплементу (рзк).

Компоненти реакції:

- антиген сапний для РЗК.

- досліджувана сироватка крові коней, нативна або консервована.

- сироватка сапна для РА і РЗК (позитивна сироватка).

- сироватка крові коней неспецифічна, неконсервована (негативна сироватка) виготовляється на біопідприємствах.

- сироватка гемолітична для РЗК, виготовлена на біопідприємствах.

- комплемент сухий для РЗК, виготовлений на біопідприємствах.

- фізіологічний розчин.

- 2,5% суспензія еритроцитів барана у фізіологічному розчині.

Кров у барана беруть вранці до годівлі, з яремної вени у флакон з скляними або металевими бусами, при цьому струшують протягом 7 – 10 хвилин або консервують розчином Альсівера. Еритроцити шляхом центрифугування при 2,5 ‑ 3 тис.об./хв. відмивають фізіологічним розчином до повного знебарвлення промивної рідини. Із осаду еритроцитів готують 2,5 % суспензію у фізіологічному розчині.

Титрування гемолітичної сироватки (гемолізину) проводять один раз у три місяці, а також при використанні нової серії. Із основного розведення гемолізину 1:100 (0,1 см³ гемолізину і 9,9 см³ фізіологічного розчину) готують такі розведення (табл.1).

Таблиця 1

Схема розведення гемолізину

Основне розведення гемолізину 1:100, см3	Фізіологічний розчин, см3	Одержане розведення гемолізину
0,2	0,8	1:500
0,1	0,9	1:1000
0,1	1,4	1:1500
0,1	1,9	1:2000
0,1	2,4	1:2500
0,1	2,9	1:3000

Після чого по 0,2 м³ кожного розведення переносять в ряд пробірок, в кожну пробірку добавляють по 0,2 см³ комплементу в розведенні 1 : 20, 0,2 см³ 2,5% суміші еритроцитів і 0,4 см³ фіз. р-ну. Штатив з пробірками струшують і ставлять на 10 хв. у водяну баню при температурі 37 ‑ 38 С. Титром гемолізину вважають найбільше його розведення, при якому спостерігається повний гемоліз еритроцитів.

Приготування гемолітичної системи. Гемолітичну систему готують змішуванням в рівних об’ємах, 2,5 % суміші еритроцитів барана та гемолітичної сироватки (гемолізин у подвоєному титрі).

Наприклад, при титрі гемолізину 1:1000 беруть 2:1000, тобто для приготування 100 см³ гемолізину беруть 0,2 см³ гемолізину з ампули і розводять в 99,8 см³ фізіологічного розчину. Отримані 100 см³ розчину гемолізину змішують з 100 см³ суміші еритроцитів. Гемолітичну систему поміщають на 20 хвилин у водяну баню при температурі 37 – 38 С для сенсибілізації еритроцитів.

Титрування комплементу. Перед постановкою головного дослідження проводять титрування комплементу у бактеріолітичній системі з позитивною сапною і негативною сироватками та 1–2 сироватками з досліджуваної партії.

Позитивну, негативну сироватку та сироватку з партії розводять 1 : 10 фізіологічним розчином (1 см³ сироватки та 9 см³ фізіологічного розчину) та інактивують за температурі 60–62 С протягом 30 хв. і розливають по 0,2 см³ в два ряди по десять пробірок.

Відбирають необхідну для даного об’єму досліджень кількість ампул (флаконів) з комплементом, розчиняють препарат у фізіологічному розчині, кількість якого вказана на ампулі (флаконі), зливають в одну ємність і перемішують. Таким чином отримують основний розчин комплементу, який зберігають в холодильнику протягом постановки реакції. З цього розчину готують розведення 1 : 20 для титрування.

Для розведення комплементу беруть додатковий ряд пробірок, в яких готують попереднє розведення комплементу, але об’єм збільшують в 10 раз. Потім дозатором переносять по 0,2 см³ розведеного комплементу у всі пробірки кожного ряду і вносять інші інгредієнти, як вказано в таблиці 2.

Титром комплементу в бактеріолітичній системі вважають мінімальну його кількість, яка необхідна для повного гемолізу суспензії еритроцитів в пробірках з негативною та досліджуваними сироватками з антигеном і без антигену, а також в пробірках з позитивною сироваткою без антигену протягом 20 хв. у водяній бані при 37–38С та затримку гемолізу в пробірках з сапною сироваткою і антигеном.

Таблиця 2

Схема титрування комплементу в бактеріолітичній системі

Компоненти реакції	Ряд пробірок у штативі	Номери пробірок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Негативна сироватка в розведенні 1:10	перший	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	другий	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Антиген в робочому титрі	перший	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	другий	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Фізіологічний розчин	перший	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	другий	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент у розведенні 1:20	перший	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	другий	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Водяна баня 20 хв. при 37-38С
Гемолітична система	перший	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
	другий	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяна баня 20 хв. при 37-38С
Наприклад	перший	чг	чг	чг	чг	пг	пг	пг	пг	пг	пг
	другий	чг	чг	чг	чг	пг	пг	пг	пг	пг	пг
Додатковий ряд пробірок для попереднього розведення комплементу
Комплемент у розведенні 1:20		0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0
Фізіологічний розчин		1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	0,6	0,4	0,2	-

Примітка: ЧГ- частковий гемоліз; ПГ- повний гемоліз.

Приготування комплементу. Кількість комплементу для головного досліду визначають за формулою:

		Т		·		П
Х	=		----------
					20

де Х - кількість комплементу, необхідна для головного досліду;

Т - титр комплементу в бактеріологічній системі;

П - кількість пробірок в реакції;

20 - розведення комплементу (1:20).

Наприклад, в досліді 200 пробірок, титр комплементу (згідно табл.2) – 0,1.

Тобто, кількість його для проведення досліду:

		0,1	·	200
1,0 см3	=	--------------
			20

Необхідна кількість розведеного комплементу для головного досліду дорівнює 40 см³ (0,2  см³·200). Тобто до 1,0 см³ основного розчину комплементу добавляють 39,0 см³ фізіологічного розчину.

Проведення головного дослідження. Сироватки досліджують у розведенні 1 : 5, 1 : 10 з антигеном та 1 : 5 без антигену (визначення антикомплементарності сироватки). При масових дослідженнях допускається постановка реакції в одній пробірці з розведенням сироватки 1 : 10 з антигеном. Для дослідження проб в одній пробірці дозатором беруть 0,02 см³ сироватки і 0,18 см³ фізіологічного розчину.

Для дослідження проб у трьох пробірках в першу наливають 0,1 см³ досліджуваної сироватки і додають 0,4 см³ фіз. р-ну (розведення 1 : 5). З першої пробірки переносять у другу 0,2 см³ і 0,1 см³ у третю, в яку потім додають 0,1 м³ фіз. р-ну.

Таблиця 3

Головне дослідження

Компоненти реакції	Перше масове дослідження		Повторне дослідження			Контроль гемолітичної системи
	Пробірки з досліджуваними сироватками	Контроль гемолітичної системи	Пробірки для кожної досліджуваної сироватки
			1	2	3
Досліджувані сироватки	0,04	-	0,04,	0,04	0,02
Фізіологічний розчин	0,06	0,6	0,36	0,16	0,18	0,6
Інактивація сироваток
Антиген у робочому титрі	0,2	-	-	0,2	0,2	-
Комплемент у робочому титрі	0,2	-	0,2	0,2	0,2	-
Водяна баня 37 – 38 С- 20 хв.
Гемолітична система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяна баня 37 ‑ 38 С – 20 хв.

При постановці головного дослідження одночасно ставлять такі контролі:

- позитивна сапна і негативна сироватки в тих же розведеннях, що і досліджувані з антигеном і без антигену ;

- антиген без сироватки (на антикомплементарність);

- антиген без сироватки і комплемента (на гематоксичність);

- гемолітична система з фізіологічним розчином.

Якщо досліджувані сироватки в одній пробірці ( розведення 1 : 10 з антигеном) дали затримку гемолізу, їх досліджують повторно у трьох пробірках.

Облік результатів реакції проводять двічі: зразу після останнього прогрівання пробірок у водяній бані і на наступний день після зберігання пробірок при температурі 4 ‑ 8 С.

Спочатку враховують результати контролів. Якщо в пробірках з позитивною сироваткою і антигеном, з антигеном без сироватки і компліменту, з гемолітичною системою і фізіологічним розчином буде повторна затримка гемолізу, а в пробірках з негативною сироваткою і антигеном, з сапною і негативною сироватками без антигену із антигеном без сироватки - повний гемоліз, постановку реакції вважають правильною і проводять облік результатів.

Реакцію оцінюють за ступенем затримки гемолізу еритроцитів, яку визначають за шкалою, приготовленою перед обліком реакції. Для цього вміст 3 ‑ 5 пробірок з повним гемолізом зливають в одну, потім гемолізовану рідину і фізіологічний розчин розливають в пробірки за такою схемою (Табл. 4). Відповідно до цієї шкали встановлюють ступінь затримки гемолізу еритроцитів в кожній пробірці.

Таблиця 4

Оцінка реакції зв’язування комплементу

Компоненти	Номери пробірок
	1	2	3	4	5
Гемолізована рідина (см3)	1,0	0,75	0,5	0,25	-
Фізіологічний розчин (см3)	-	0,25	0,5	0,75	1,0
Процент гемолізу	100	75	50	25	0

Реакцію оцінюють в хрестах в залежності від відсотка гемолізованих еритроцитів: ++++ (4 хрести) - повна відсутність гемолізу;

+++ (3 хрести) - гемоліз 25% еритроцитів;

++ (2хрести) - гемоліз 50% еритроцитів;

+ (1хрест) - гемоліз 75% еритроцитів;

- (мінус) - повний гемоліз.

Діагностичним титром сироватки вважають розведення її 1 : 10. При затримці гемолізу еритроцитів в цьому розведенні сироватки на ++++ і +++ реакцію вважають позитивною незалежно від результатів реакції з сироваткою в розведенні 1:5. При затримці на ++ і + реакцію вважають сумнівною, якщо затримка гемолізу в розведенні сироватки 1:5 відповідає ++++ або +++. У всіх інших випадках реакцію вважають негативною.