Тема VI. Культура гаплоидных клеток.

Работа 1. Получение каллусов из пыльников вишни и яблони.

Объяснение. Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом. Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. Гаплоиды по внешнему виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.

Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений.

Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия "средних" или "поздних" одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.

Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-ЬАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей в питательные среды добавляют активированный уголь.

Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4-6^о С в течение 2-8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре 25 + 2^о С.

]На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидныи зародыш (сначала образуется 40-50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.

В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, пробирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.

Ход работы.

1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого поместить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5-6 раз) стерильной дистиллированной водой.

2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, осторожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей.

3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверхность питательною среды в пробирки по 5-10 пыльников в каждую.

4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26^о С и влажностью 70 %.

5. Результаты работы зарисовать через 2-4 недели.

Работа 2. Получение растений-регенерантов из пыльцевых каллусов вишни.

Объяснение. Способность каллусов к морфогенезу определяется балансом фитогормонов как в питатальных средах, так и в самих клетках (эндогенные фитогормоны). Для получения растений-регенерантов используют среды, содержащие кинетин – 0,1-0,3 мг/л, ГК – 4 мг/л, 6-БАП – 0,5-1,5 мг/л, ИУК – 0,5-1,5 мг/л. Каллусы культивируют при 16 часовом фотопериоде и интенсивностью освещения 2-3 кLх.

Морфогенный каллус имеет плотную консистенцию, бугристую поверхность, молочно-белый, желтоватый и зеленоватый цвет.

Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических, богатых цитоплазмою клеток, имеющих заполненные крахмалом пластиды и хорошо развитые митохондрии. Центральная часть каллуса представлена крупными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чередуются с меристематическими участками.

Для индукции побегообразования, каллусы переносят на среды для регенерации: МС + кинетин – 1-2 мг/л, 6-БАП – 3-6 мг/л, аденин – 1-2 мг/л, ГК – 1-2 мг/л, феруловая кислота – 0,5-0,7 мг/л, ИУК – 0,2-0,4 мг/л, НУК – 0,2-0,4 мг/л, ИМК – 0,2-0,4 мг/л, 2,4-Д – 0,1-0,3 мг/л.

Через 1,5-2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часовом фотопериоде при освещенности 3 кLх начинается пролиферация почек и побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4-6 недель.

Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов и растений-регенерантов.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом, пробирки с пыльцевыми каллусами, пробирки со средами для получения морфогенного каллуса, пробирки со средами для регенерации, препарировальные иглы, пинцеты.

Ход работы.

1. В условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и перенести на стерильную поверхность. Стерильной препарировальной иглой выделить зону морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней плотности).

2. Стерильной препарировальной иглой перенести кусочек (5-6 мм) морфогенного каллуса в пробирку со средой для регенерации, закрыть пробирку стерильной пробкой.

3.Перенести штативы с пробирками в световую культуральную комнату с температурой 25 + 2^о С, влажностью 70 %, освещенностью 4 кLх.

4. Через 4-6 недель зарисовать результаты работы.

5. Побеги перенести в пробирки со средами для пролиферации побегов: МС +1-2 мг/л 6-БАП, 1 мг/л НУК.

6. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без гормонов, МС +1-2 мг/л ИМК + 1мг/л ГК и поместить на 20 дней в темноту.

Контрольные вопросы к теме VI.

1. Для чего используются гаплоиды в селекции и генетике?

2. Как получить морфогенный каллус из пыльников?

3. Каковы основные способы получения гаплоидных и дигаплоидных растений-регенерантов?

ТЕРМИНОЛОГИЯ

In vitro – выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях.

Тотипотентность – свойство соматических клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма.

Омнипотентность ядер – сохранение ядрами соматических клеток растений всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической информации.

Культура тканей in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.

Культура органов in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов.

Культура корней in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней.

Культура меристем in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями.

Культура суспензионная или культура клеток in vitro – асептическое выращивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде.

Культура зиготических зародышей in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.

Апекс – верхушечная часть стебля или корня.

Меристема – образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками.

Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной почки.

Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих.

Фитогормоны – (гормоны растений) – биолигически активные соединения, образующиеся в раститениях в малых количествах, вызывающие специфический ростовой или формообразовательный эффект.

Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие ррост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.

Цитокинины – фитогормоны (кинетин, 6-БАП), активизирующие развитие меристем, стимулирующие образование почек.

Гиббереллины – фитогормоны (ГК и др.), активизирующие рост стеблей, вызывающие прорастание семян.

ГК – гибберелловая кислота

ИУК – -индолилуксусная кислота

НУК – -нафтилуксусная кислота

2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

6-БАП – 6-бензиламинопурин

Клональное микроразмножение или микроклональное размножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному (метод вегетативного размножения растений в культуре in vitro).

Эксплант фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.

Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих.

Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролифирации и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации).

Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно.

Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между клетками.

Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других.

Морфогенез in vitro – процесс формообразования, то есть заложения, роста и развития клеток (цитогенез), тканей (гистогенез) и органов (органогенез) в культуре клеток и тканей in vitro.

Ризогенез – процесс заложения, роста и развития корней.

Регенерация – восстановление целостного организма из клетки, ткани, органа.

Эмбриоидогенез – процесс образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) неполовым путем в культуре тканей и клеток in vitro.

Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших in vivo или in vitro путем неорганизованной пролиферации.

Культура каллусов in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре каллусов, возникших путем дедифференциации и пролиферации клеток, тканей, органов растений.

Культура «привыкших» тканей – выращивание тканей, возникших путем редифференциации или мутации клеток нормальных каллусных тканей, и способных расти на питательных средах без гормонов.

Трансплант – часть каллусной ткани, используемая для переноса на свежую питательную среду.

Инокулюм – часть клеточной суспензии, используемая для переноса на свежую питательную среду.

Субкультивирование – процесс переноса транспланта или инокулюма в культуральный сосуд на свежую питательную среду.

Цикл выращивания – период от помещения клеточного инокулюма или каллусного транспланта на питательную среду до последующего субкультивирования.

Ростовой цикл – рост популяции клеток в цикле периодического выращивания, характеризующийся сигмоидальной (S-образной) кривой. Фазы ростового цикла: латентная (лаг-фаза), экспоненциальная (лог-фаза, фаза логарифмического роста), замедления роста, стационарная, деградации.

Штамм – культура, возникшая после первого субкультивирования, и состоящая из многих клеточных линий, возникших из клеток первичного каллуса.

Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки.

Клон – культура, возникшая из одной клетки.

Клеточная селекция in vitro – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.

Сомаклональные вариации и варианты – фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органелльных цитоплазматических геномов культивируемых клеток. От истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).

Эпигенетические вариации – фенотипическое выражение дифференциальной активности генов. От мутаций и сомаклональных вариаций отличаются тем, что не сохраняются в цикле клетка-растение-клетка.

Соматическая (парасексуальная) гибридизация – способ создания гибридных клеточных линий и соматических гибридов растений путем генетической рекомбинации хромосом и генов ядра и органелл вне сексуального цикла, например путем слияния изолированных протопластов.

Изолированный протопласт – растительная клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного или механического разрушения.

Цитопласт – ограниченный мембраной участок цитоплазмы, возникший при фрагментации изолированного протопласта.

Субпротопласт – изолированный протопласт, потерявший часть цитоплазмы, сохранивший ядро.

Слияние изолированных протопластов – формирование одной клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран.

Культура изолированных протопластов – выращивание клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной среде, содержащей в качестве дополнительного компонента осмотически активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для данного вида концентрации. При регенерации стенок изолированные протопласты превращаются в культуру клеток.

Соматический гибрид – растение, полученное путем гибридизации изолированных протопластов.

Цибрид – растение, полученное при слиянии изолированного протопласта с цитопластом, протопластом с инактивированным ядром или с энуклеированным протопластом.

Кариотип – набор хромосом, характерных для данного вида.

Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся основным числом хромосом в полиплоидной серии (символ Х).

Гаплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся набором хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного виду (символ n).

Диплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся двойным набором гомологичных хромосом, представленным числом, характерным для данного вида (символ 2n).

Псевдодиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся диплоидным числом хромосом, отличающиеся от зигот данного вида по кариотипу.

Полиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся умноженным основным числом хромосом (символ 3Х, 4Х и т.д.).

Эуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, кратным Х.

Анеуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, отклоняющимся от Х и от чисел, кратных Х.

Мутация – изменения в генетическом материале клеток путем перестройки ДНК ядер и органелл, изменений в структуре хромосом или уровне плоидности организма.

Рецессив – ген или генетически обусловленный признак, проявляющийся в диплоидной клетке или организме при условии, когда оба набора хромосом несут данные гены.

Доминант – ген, проявляющийся как признак при условии, когда гомологичные наборы имеют разные гены.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1.

Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга.

№ п.п.	Компонент среды	Количество вещества
	Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1. 2. 3. 4.	KNO3 NH4NО3 KH2PO4 MgSO4 . 7H2O или MgSO4 безводный	38 33 3,4 7,4 3,6
5.	CaCl2 . 2H2O или CaCl2 безводный	8,8 6,65
	Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.	Na2MoO4 . 2H2O CuSO4 . 5H2O H3BO3 MnSO4 . 5H2O или MnSO4 . 4H2O ZnSO4 . 7H2O KJ CoCl2 . 6H2O	25 2,5 620 2410 2230 860 83 2,5
13.	FeSO4 Na2 ЭДТА	557 745

Таблица 2

Среда Мурасиге-Скуга (М-С) для клеточных и тканевых культур

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Мезоинозит Глицин Сахароза	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 0,1 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 2 мг/л 30 г/л
рН 5,6-5,8

Таблица 3

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Витамин В12 Никотиновая кислота Фолиевая кислота Мезоинозит Гидролизат казеина Аденин Пантотенат Са Рибофлавин Биотин Активированный уголь ГК Кинетин Сахароза Глюкоза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 0,015 мг/л 2 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 1 г/л 40 мг/л 10 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 10 г/л 2 мг/л 0,5 мг/л 20 г/л 20 г/л 7 г/л
рН 5,7-5,8

Таблица 4

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для микроразмножения картофеля черенкованием побегов

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аденин Кинетин Гибберелловая кислота Пантотенат Са	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 40 мг/л 0,5 мг/л 2 мг/л 10 мг/л

Продолжение таблицы 4

Активированный уголь Сахароза Агар-агар	10 г/л 30 г/л 7 г/л
рН 5,8

Таблица 5

Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега.

№ п.п.	Компонент среды	Количество вещества
	Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1. 2. 3. 4.	KNO3 (NH4)2SO4 MgSO4 . 7H2O NaH2PO4 . H2O	60 2,68 10,0 3,0
5.	CaCl2 . 2H2O	3,0
	Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6. 7. 8. 9. 10. 11.	Na2MoO4 . 2H2O CuSO4 . 5H2O H3BO3 MnSO4 . H2O ZnSO4 . 7H2O CoCl2 . 6H2O	25 7,5 300 1000 200 2,5
12.	FeSO4 Na2 ЭДТА	557 745

Таблица 6

Среда Гамборга-Эвелега

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Мезоинозит 2,4-Д Сахароза	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 10 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 100 мг/л 2 мг/л 20 г/л
рН 5,8

Таблица 7

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для клубнеобразования у картофеля.

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аскорбиновая кислота Кинетин Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 0,5 мг/л 50 г/л 7 г/л
рН 5,8-6,0

Таблица 8

Приготовление маточных растворов для среды Блейдза.

№ п.п.	Компонент среды	Количество вещества
	Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1. 2. 3. 4. 5.	KNO3 KCl KH2PO4 NH4NO3 MgSO4 . 7H2O или MgSO4 безводный	20 1,3 6 20 1,44 0,7
6.	Ca(NO3)2 . 4H2O	10,28
	Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
7. 8. 9. 10.	H3BO3 MnSO4 . H2O или MnSO4 . 5H2O ZnSO4 . 7H2O KJ	160 440 627 150 80
11.	FeSO4 Na2 ЭДТА	557 745

Таблица 9

Среда Блейдза для каллусогенеза.

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaNO3 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аскорбиновая кислота Мезоинозит 2,4-Д Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 0,1 г/л 2 мг/л 20 г/л 7 г/л
рН 6,0

Таблица 10

Среда Блейдза для соматического эбриогенеза.

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaNO3 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аскорбиновая кислота Мезоинозит ИУК Кинетин АБК Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 2,5 мл/л 50 мл/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 0,1 г/л 0,2 мг/л 0,2 мг/л 0,05 мг/л 20 г/л 7 г/л
рН 6,0

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений // Рост растений и природные регуляторы – М.: Наука, 1977.

2. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука, 1986.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.

4. Гамбург К.3., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений – Новосибирск: Наука, 1990.

5. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений – Киев: Наукова думка, 1984.

6. Калинии Ф.Л., Бутенко Р.Г. Методы культуры тканей в физиологии растений – Киев: Наукова думка, 1980.

7. Калинин Ф.Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений – Киев: Наукова думка, 1992.

8. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М.: Наука, 1983.

9. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин // Биортехнология. Т. З. – М.: Высшая школа, 1987.

10. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии: Методические указания / Сост. Г.М. Артамонова, С.И. Герасимова, С.В. Дегтярев, Е.З. Кочиева, Д.В. Калашников, И.К. Блиновский, Л.И. Хрусталева. Под ред. акад. ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи. Москва: Изд-во МСХА, 1991.

11. Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве / Сб. науч. трудов ВНИИГиСП – Мичуринск, 1989.

12. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Порофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологий. – М: Наука, 1990.