Степень агрегированности и жизнеспособности суспензии.

Фракции

Препараты

1

2

3

Поля зрения

1

2

3

1

2

3

1

2

3

о

н

о

н

о

н

о

н

о

н

о

н

о

н

о

н

о

н

одиночные клетки

мелкие агрегаты (2-5 клеток)

средние агрегаты (6-20 клеток)

крупные агрегаты (21-50 клеток)

очень крупные агрегаты (50 и более клеток)

Примечание: о – окрашенные клетки и агрегаты,

н – неокрашенные клетки и агрегаты.

Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КЛОНОВ НА АГАРИЗОВАННЫХ СРЕДАХ. МЕТОД ПЛЕЙТИНГА.

Объяснение. Культивирование отдельных (одиночных) клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость клонового материала. Одиночные клетки или изолированные протопласты используются в клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. В эти клетки можно ввести новые гены, в то же время – это хорошая модель для изучения онтогенеза и физиологии клетки.

Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие на жидкой питательной среде; мацерированные ткани растений (мезофилл листа); изолированные протопласты после восстановления клеточной стенки.

Наиболее эффективными методами для получения одиночных клеток являются: метод «кормящего слоя» или «культуры-няньки», кондиционированных сред, микрокапель. Для получения генетически стабильных клонов и клеточной селекции используется метод плейтинга.

Материалы и оборудование. Колбы с суспензией, стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр, чашки Петри с агаризованной средой, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, 96 % спирт.

Ход работы.

1. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток) и смешать с 5 мл агаризированной (1,4 % агара) среды для культивирования каллуса. Работу проводить в стерильной посуде: мерном цилиндре, стакане.

2. Полученную смесь разлить в стерильные чашки Петри слоем до 1 см.

3. Чашки Петри закрыть крышками и герметизировать парафином.

4. Количество колоний подсчитать через 4-6 недель.

5. Результаты зарисовать, подсчитать плотность высева по формуле:

количество образовавшихся колоний

Э ффективность высева =  100 %

количество высеянных клеток

Контрольные вопросы к теме IV.

1. Что такое суспензионные культуры, и каковы основные способы их получения?

2. Как определить степень агрегированности и жизнеспособности суспензий?

3. Как подсчитать плотность суспензии?

4. Каковы основные способы культивирования одноклеточных суспензий?

5. В каких отраслях производства и науки используют суспензионные культуры?