Добавление

Глюкозы (г)

Глюкоза Глюкоза

Глюкоза Глюкоза

Г Г

Белок, связывающий глюкозу

Высвободившийся белок

Схема аффинной хроматографии

Электрофорез. Принцип заключается в способности молекул белков и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (-), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Различия в заряде и молекулярной массе обуславливают разрешающую способность электрофоретических методов.

Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля (), заряда белков (z) и сопротивления трения (f). Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением:

z

f

Впервые метод электрофореза разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных (ПААГ) гелей.

К ним относится диск-электрофорез в ПААГ (от англ. discontinuous – прерывистый), при котором используются два буферных раствора с различными значениями рН (Laemmli, 1970). Разделение белков осуществляют в присутствии ДДС-Na с применением гелей различной пористости (концентрирующие, разделяющие) Для обнаружения белков после разделения гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.

Для электрофоретического разделения применяется двумерный электрофорез в ПААГ, в соответствии с которым смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем - в гелевых пластинах в вертикальном положении (рисунок 20). При разделении белков, например, гороха этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.

вертикальное

направление

горизонтальное

направление

3

Смесь

белков

1 2 3 4 5 6

7

1

2

5

6

7

4

Двумерный электрофорез

Метод изоэлектрического фокусирования белков имеет очень высокую разрешающую способность. В основе него лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолиты), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу – сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку наносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.

В химии белка применяют и другие разновидности электрофоретического разделения (иммуноэлектрофорез, изотахофорез), метод пептидных карт. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.

На последнем этапе выделения и очистки белков определяется гомогенность белка с применением, 2-х методов. Наиболее достовернымиявляются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы, растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одним компонентом и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным (однородный). У гомогенного белка на кривой растворимости, представляющей собой зависимость количества растворенного белка от общего его содержания в одном и том же количестве растворителя, имеется только один перегиб, тогда как у гетерогенного – столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.