4. Методы выделения, очистки и фракционирования белков

Для изучения свойств белков обязательным условием является получение их в индивидуальном и, по возможности, не денатурированном состоянии.

Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратация, ферментативная активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов. Типичным примером необратимой денатурации белков является выпадение их в осадок под действием трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить проведением операций при температуре не выше +4 С.

Методы выделения и очистки белков. Схема выделения белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизация), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии.

Гомогенизацию объектов рассматривают как начальную стадию выделения белков, но способ ее определяется конкретной задачей. Например, выделение ферментов из растительных материалов затруднено из-за экстрагирования большого количества фенолов, которые взаимодействуя с карбонильными группами пептидных групп при помощи водородных связей, вызывают денатурацию белка и потерю ферментами активности. Добавление в экстракт поливинилпирролидона, которые образуют с фенолами нерастворимые комплексы, предотвращает инактивацию ферментов.

Разрушение клеточной структуры проводят измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода "азотной бомбы". В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается, и клетки разрушаются.

На эффективность гомогенизации влияет не только способ разрушения клеточных структур, но и вид исследуемого материала. Так, животные клетки разрушаются относительно быстро, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные из-за присутствия клеточных стенок – трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с песком, абразивным порошком или обрабатывают его лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими ферменты целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей, либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен. Для определения ферментативной активности белка достаточно, например, одноразовой экстракции, тогда как для количественного определения белковых фракций зерна – трех- или пятикратной. Условия экстрагирования белков (время, гидромодуль, температура и т.д.) подбираются эмпирически, основываясь на методиках ведущих научных школ или индивидуальном опыте.

Большинство белков животных тканей хорошо растворяются в 5 – 10 % растворах солей, тогда как для белков зерновых культур применяют буферные системы со значениями рН от кислых до слабощелочных (фосфатные, боратные, цитратные, трис-HCl), органические растворители и детергенты, разрывающие белок-липидные или белок-белковые связи:

СН₃

СН₃ – (СН₂)₇ – (С₆Н₄) – О – СН₂ – СНОН)₁₀Н 

Тритон Х-100 С₁₆Н₃₅ – N⁺ – CH₃



СН₃ – (СН₂)₁₀ – СН₂ – О – SО₃Na CH₃

Додецилсульфат натрия (ДДС-Na) Цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ)

Растворители подбираются с учетом разрыва в белках определенных типов связей. Так, уксусная кислота ослабляет ионные связи, сообщая молекулам одноименные положительные заряды, мочевина – водородные и гидрофобные, салицилат натрия и ДДС-Na – гидрофобные и ионные, а водные растворы спиртов – водородные и гидрофобные взаимодействия. Органические растворители разрывают белок-липидные связи.

Методы фракционирования и очистки от небелковых соединений основаны на различиях в растворимости, заряде, размерах молекул, сродстве к специфическим химическим группам.

Осаждение. Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Процесс основан на понижении растворимости белка, которая зависит от их способности к гидратации. У глобулярных белков высокий уровень гидратации обеспечивается расположением на их поверхности гидрофильных групп. Осадители разрушают гидратную оболочку и вызывают осаждение белка. При повышенной концентрации соли или органических растворителей (спирт, ацетон) в растворе происходит сближение ионных атмосфер, образуемых противоионами белка, что способствует сближению их до расстояния, на котором межмолекулярные силы ван-дер-ваальсова притяжения перевешивают кулоновские силы отталкивания. Это приводит к слипанию белковых частиц и выпадению их в осадок.

Для высаливания часто применяется сульфат аммония, с которым белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность, однако главную роль при этом играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе ():

 = ½  СV²,

где С – концентрация каждого вида иона; V – валентность ионов

Глобулины выпадают в осадок при 50 % насыщении, альбумины – при 100 % насыщения растворов солей, а при ступенчатом фракционировании от 20 до 100% насыщения могут выпадать белки и других классов (проламины, глютелины).

Изоэлектрическое осаждение. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспарагиновой, глутаминовой кислот (отрицательный заряд) и остатками лизина и аргинина (положительный заряд). По мере повышения рН заряд белков изменяется от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы, частицы слипаются и выпадают в осадок.

Центрифугирование. Для отделения осадка белка от раствора используется центрифугирование. Частицы осажденного вещества под действием центробежной силы оседают на дне центрифужных стаканов, формируются в плотный осадок, с которого легко сливается оставшийся раствор (надосадочная жидкость, или супернатант). Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги) создают центробежное ускорение порядка 10⁵g (т.е. 10⁵ ускорений свободного падения), что позволяет осаждать даже некоторые крупные надмолекулярные агрегаты - рибосомы и вирусы.

В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждение) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:

v

v , w²r

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; w – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.

Величина S, равная 110^-13 c, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, который впервые разработал ультрацентрифугу.

Методы диализа, кристаллизации, ультрафильтрации применяются для очистки белков от низкомолекулярных соединений (соли, сахара, аминокислоты).

При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан из нитрата целлюлозы, коллодийная пленка), через которые белки не

д

Черточки - вода,

белые кружечки - белок,

черные кружки - хлористый натрий.

иффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат в сосуд с водой. Непрерывный ток воды через сосуд приводит к полному переходу в него всех проходящих через целлофан веществ, а белки остаются внутри диализного мешочка

В методе ультрафильтрации, который применяется в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.

Адсорбционная хроматография основана на различиях на различном сродстве (полярности) компонентов смесей к определенным веществам - сорбентам. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент (гель фосфата кальция, оксид алюминия, активированный уголь, силикагель, пористое стекло) или используют, например, готовые алюминиевые пластины (тонкослойная хроматография – ТСХ) с нанесенным уже адсорбентом, на которые наносят в небольшом объеме растворителя исследуемый образец. Компоненты смеси адсорбируются на адсорбенте, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собираются с помощью автоматического коллектора фракций или количественно исследуются на приборе денситометр (ТСХ).

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются по длине колонки или бумаге. Для анализа пептидов и аминокислот чаще используют хроматографию на бумаге. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей (бутиловый спирт–уксусная кислота–вода). Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов.

Метод ионообменной хроматографии белков или аминокислот основан на разделении на основе различий в заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то – на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:

CH₂ – O – CH₂ – COO^–

СН₂ – О – С₂Н₄N⁺H (C₂H₅)₂

O

O

O

O

R – O

R – O

Диэтиламиноэтилцеллюлоза Карбоксиметилцеллюлоза

(ДЭАЭ – целлюлоза) (КМЦ)

Положительно заряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлористого натрия или изменением рН элюирующего буфера. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами белков. Белки с меньшим положительным зарядом вымываются с колонки первыми, с большим зарядом – последними.

Гель-фильтрация или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или другими типами (агарозные, полистирольные). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные – только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее.

В итоге белки распределяются по М.М. и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических фракций.

Инсулин (6000)

NaCl(36,5)

Мелкие молекулы белка внутри сефадекса

Гранулы

сефадекса

Мальтоза (348)

Глюкоза

(80)

Крупные молекулы белка между гранулами сефадекса

Объем элюата, мл

Рисунок 17 – Распределение молекул среди гранул сефадекса

Рисунок 18 – Распределение веществ, различающихся по молекулярной массе

Хроматография по сродству (афинная хроматография) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкоза) ковалентно присоединяют к носителю (иммобилизуют), после чего наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся с глюкозой белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентра­ции. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в рас­творе

Колонка

Колонка