1.5 Четвертичная структура –
Некоторые белки, обладающие описанными уровнями структуры, состоят из нескольких полипептидных цепей, соединенных вместе. Каждая такая цепь называется субъединицей, соединяются они слабыми связями.
Примеры
Гемоглобин крови имеет 4 полипептидных цепей, каждая связывает молекулу O2.
Ферменты - глутаматдегидрогеназа (8 субъединиц), лактатдегидрогеназа (4 субъединицы). Регуляция активности ферментов.
Белок диссоциирует на субъединицы под действием реагентов, разрывающих слабые связи (мочевина, детергенты, солевые растворы).
РЕЗЮМЕ
Белки состоят из аминокислотных остатков, связанных между собой пептидными связями, образующих полипептидные цепочки, которые благодаря водородным, ионным, дисульфидным связям и гидрофобным взаимодействиям определенным образом располагаются в пространстве, т.е. имеют определенную конформацию. При нормальных физиологических условиях белок имеет нативную конформацию.
2. Физико-химические свойства белков
2.1 Форма и размер белковых молекул
Форма молекул взаимосвязана с функциональной ролью в клетке.
3 Типа белков:
- Фибриллярные, образующие длинные волокна без значительного числа изгибов и петель. Содержатся в костях, сухожилиях, шелк (кератин волос, рогов, фиброин шёлка). Они не растворимы в воде и разбавленных солевых растворах.
- Глобулярные, имеющие компактную форму запутанного клубка, которая благоприятна для взаимодействия с другими молекулами (ферменты, гормоны);
Форму белковой молекулы выражают отношением длины большой оси к малой: в/а. Глобулярные белки могут различаться по форме: сигара, эллипсоид вращения, иглы и т. д. Растворимые в воде.
- Промежуточный тип: растворимые в водных, солевых растворах, но состоящие из длинных фибриллярных структур (Миозин – белок мышц, фибриноген крови).
2.2 Молекулярные массы белков колеблются от ~ 6000 до 1 000 000 Да и выше. 1 дальтон = 1,661 * 10-24 грамм.
Методы для определения молекулярных масс белков
2.2.1 Осмотическое давление. Если вещество, растворенное в воде, отделено от чистой воды мембраной, проницаемой для воды и непроницаемой для вещества, то вода будет поступать внутрь объема, где находится раствор. Уровень воды в мембранном пространстве поднимется. Это избыточное давление равно осмотическому давлению (π ).
π = R* C *T ,
где π -осмотическое давление в атмосферах;
R – универсальная газовая постоянная;
С – молярная концентрация растворенного вещества;
Т – абсолютная температура
,
где c – концентрация в граммах на литр; М – молекулярный вес.
π
=
М
= (R
c
T)
/
π
2.2.2 Метод седиментацоннго анализа. разработан в 1925г. Сведбергом, основан на применении ультрацентрифугирования. В ультрацентрифуге в сотни тысяч раз увеличивается сила тяжести и молекулы белка оседают в растворе. По скорости их оседания (седиментации) вычисляют молекулярную массу белка.
2.2.3. Диффузионный метод – определение скорости диффузии, которая обратно пропорциональна величине молекулярного вещества.
2.2.4. По светорассеиванию
В растворе NaCl свет не рассеивается, т.к. размеры молекул меньше, чем длина волны светового пучка (светорассеивание). По мере увеличения размеров молекул они начинают отражать лучи света по всем направлениям, т.е. происходит рассеивание света.
i/y ≈ K *С *M
где i – интенсивность света, рассеивающегося под углом α; у – интенсивность падающего света; С – концентрация белка; М – молекулярный вес.
y
i
2.2.5. Вискозометрический метод. Определение η – растворов, которая тем больше, чем больше молекулярный вес белка.
Измерение η используют для определения формы, асимметрии молекул. Характеристическая η ????
2.2.6 Гель фильтрация. Хроматографическую колонку калибруют, для этого используют белки известного молекулярного веса и определяют молекулярный вес белка путем сопоставления и экстраполяции.
2.2.7 Электрофорез в ПААГ с ДСН
Если белок обработать ДСН, то белок денатурируется, присоединяет ДСН и приобретает одинаковый отрицательный заряд. Скорость перемещения в электрическом поле будет зависеть только от молекулярного веса, причем она обратно пропорциональная молекулярному весу.
3. Изоэлектрическая точка белков
Помимо свойства иметь большой молекулярный вес для белков характерны явления осмоса, диффузии, коллоидные свойства, растворимость, оптические свойства, адсорбция и электрокинетические свойства.
Молекулы белка имеют электрический заряд, возникающий в результате диссоциации группы –СООН и –NH3OH. Группы –СООН при отщеплении H+ превращается в СОО- (белок заряжен отрицательно). Группы –NH3OH при отнятии иона ОН- придают белку положительный заряд (NH3+). Большинство белков имеют отрицательный заряд. На знак заряда и его величину влияет [Н+] и присутствие солей. Свободные [Н+] нейтрализуют СОО- и создается преобладание NH3+. В кислых растворах белок заряжается положительно, в щелочных- отрицательно, так подавляется NH3+ + ОН-, и остается СОО-.
Ионизация белков изменяется под действием нейтральных солей. Если к раствору белка добавить осторожно электролит, то заряд белка уменьшается, и при определенном значении рН равен 0. рН среды - lg [Н+], при котором на молекуле белка наблюдается равенство положительных и отрицательных зарядов, называется изоэлектрической точкой. В этой точке белок неподвижен в электрическом поле, он неустойчив и легко выпадает из растворов.
В силу гидрофильности молекул, белки не выпадают сами по себе в осадок. Молекулы белка окружены дипольными молекулами воды, что стабилизирует ее. Поэтому для выпадения белка в осадок следует обезводить молекулы белка отнятием молекулы воды. Безводные частицы белка слипнутся и выпадут в осадок. Обезвоживание проводят либо солями, либо органическими растворителями (спирт, ацетон).