1. Действуют аминопептидазой и получают n-концевую аминокислоту;
2. Примененяют метод Эдмана:
Для этого белок в щелочной среде обрабатывают, например, фенилизотиоцианатом, который с NH2 образует негидролизуемую (прочную) связь.
Далее кислотой
гидролизуют пептидную связь и получают
фенилтиогидантоиновое (ФТГ)
производное
валина:
ФТГ - валин с помощью растворителей извлекают и идентифицируют хроматографией:
Далее аналогично получают фенилтиогидантоиновое фенилаланина:
ФТГ-производные N-концевых остатков идентифицируют хроматографией. Производные поглощают свет при 265-270 нм, что используется в автоматических анализаторах - секвенаторах (от анг. sequence – последовательность).
Определение С- концевой аминокислоты включает:
1. Гидролиз пептидной связи действием карбоксипептидазы и получение аминокислоты со свободной соон группой.
Разрушение пептидных связей под действием ферментов - протеаз, протекает специфично (избирательно):
- химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматических α-аминокислот (Туr, Phe, Trp),
-трипсин гидролизует связи, образованные карбоксильными группами основных α-аминокислот (Lys, Arg);
- термолизин расщепляет пептидные связи, включающие аминокислотные остатки с гидрофобной боковой цепью (Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Trp).
Действием протеаз на полипептид, таким образом можно расщепить его на небольшие фрагменты, в которых концевые группы могут быть определены, например, по методу Эдмана.
ПРИМЕР:
Химотрипсин Трипсин
Химотрипсин Трипсин Химотрипсин
Phe-Ser
Pro-Gly-Phe
Pro-Pro Ser-Pro-Phe
Arg-Pro Phe-Arg
_____________________________________________
Брадикинин H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-
-Phe-Arg-OH
Сочетанием гидролиза с определением N- и C-концевых аминокислот и применением эндопептидаз, можно определить последовательность аминокислот.
Такими методами Сенгером расшифрована структура инсулина, состоящего из двух полипептидных цепей А и В.
В цепи А содержится 4 остатка цистеина, два из них связаны с остатками цистеина цепи В, а два других образуют мостик между собой.
Цепь В имеет 2 цистеиновых остатка, связанных цистеинами цепи А. Также связи называются дисульфидными (S-S).
Сегодня синтезируют инсулин животных, что является величайшим достижением науки.
А
В