Тема т21. . Основні технологічні прийоми регуляції процесів мікробіологічного синтезу

Основна проблема мікробіологічного синтеза - проблема продуктивності, збільшення активності, проблема надсинтезу. Одним зі шляхів рішення цих завдань може бути створення нового високопродуктивного штаму-продуцента широко розповсюдженими методами генетики й селекції або шляхом конструювання нового генома методами генної інженерії. При доборі або створенні нового штаму-продуцента можуть бути сформульовані наступні основні завдання, що характеризують продуцент:

• оптимальна швидкість росту у ферментерах;

• стабільність фізіологічних показників;

• максимальна утилізація джерел харчування із середовища для культивування;

• зміни в структурі генома, що знімають необхідність мати в середовищі індуктор (при біосинтезі індуцибельних ферментів);

• мінімальний синтез інших метаболітів;

• відсутність серед продуктів метаболізму токсичних метаболитів (алергени, онкогени, високотоксичні антибіотики);

• високий вихід цільового продукту;

• швидке нагромадження цільового продукту.

Максимум своїх можливостей культура може виявити, коли технологічний процес ферментації відповідає фізіологічним особливостям продуцента.

Регуляція технологічних процесів мікробіологічного синтезу заснована на характерних для даного процесу біохімічних реакціях, які здійснюються продуцентом у конкретних умовах культивування. До числа таких реакцій можуть бути віднесені шляхи асиміляції основних вуглець- і азотовмісних компонентів середовища, реакції синтезу низькомолекулярних метаболітів і ін. Знання механізмів регуляції синтезу ферментних білків необхідно як при одержанні ферментів, так і при синтезі низькомолекулярних сполук, наприклад вторинних метаболітів. Відомі труднощі в оцінці реальних факторів регуляції полягають у тому, що більшість метаболітів поряд з їхньою участю в конструктивному й енергетичному метаболізмі виконують і регуляторні функції.

У мікробних клітинах функціонують різні системи регуляції обміну речовин (табл.21.1). Принципові відмінності між ними полягають у наступному: одна регулює синтез ферментів, інша - їхню активність. Посередниками в здійсненні регуляції є низькомолекулярні сполуки, які або синтезуються клітиною, або надходять у клітину з навколишнього середовища.

Основні дані про механізми регуляції були отримані на мутантних штамах або в досвідах in vitro на моделях. Останні не завжди в стані відтворити умови, близькі до in vivo.

Застосування терміна "індукція" не завжди коректно. У більшості випадків мова може йти лише про первинний фізіологічний сигнал. Істинний індуктор повинен бути локалізований у клітині, тобто необхідна наявність транспортної системи для переносу даної речовини в клітину.

Існує більша група конститутивних ферментів, синтез яких не визначається наявністю індукторів. Це в першу чергу центральні ферменти метаболізму вуглеводів, які є загальними для більшості вуглеводів. У цих випадках введення індукторів не є необхідним.

При мікробіологічному синтезі ферментів як індуктори звичайно використовують субстрат дії ферменту. Однак у ході обміну речовин і синтезу відповідного ферменту відбувається деградація індуктора, порушення його структури. Щоб уникнути подібної ситуації й зберегти синтез ферменту більш тривалий час, запропоновано вводити в середовища речовини, які мають стеричну подібність із індуктором, тобто є структурними аналогами й можуть виконувати функції індуктора, але не асимілюватися клітиною (або асимілюватися, але дуже повільно).

Таблиця 21.1 -Механізми регуляції метаболізму

Вид регуляції	Коротка характеристика
Регуляція метаболітами	Активність ферментів і їхня кількість не змінюються. Інтенсивність метаболізму залежить від концентрацій метаболітів
Ферментна регуляція
Регуляція кінцевим продуктом	Загальний механізм регуляції біосинтетичних шляхів у бактерій полягає в інгібуванні ферменту, що каталізує нову стадію метаболічного шляху кінцевим продуктом цього шляху за типом зворотного зв'язку
Регуляція в результаті обмеженого протеоліза	Обмежений протеоліз може індукувати фізіологічну функцію шляхом перетворення білка-попередника в його біологічно активну форму або забезпечує припинення якої-небудь біологічної активності
Регуляція шляхом оборотного фосфорилювання	Циклічний перехід ферментів, що каналізують ключові стадії метаболізму, з фосфорильованих форм у дефосфорильовані
Регуляція шляхом ковалентної модифікації	Здійснюється посттрансляційною модифікацією амінокислот у складі білків. У бактерій здійснюється шляхом зворотного аденилювання, уридилювання й ацетилювання
Аллостеричні регуляції	Заснована на змінах конформації ферменту, ведучих до зміни його активності
Генна регуляція
Позитивна регуляція транскрипції	Регулюючі фактори активують промотор. Промотор лактозного оперона активується під дією цАМФ і білка БАК, якщо в клітині немає глюкози
Негативна регуляція транскрипції	Характерна для генів, об'єднаних в оперон. Інтенсивність транскрипції регулюється в результаті взаємодії оператора з білком-репресором. При синтезі репресибельного ферменту репресор блокує оператор, при синтезі індуцібельного фермента-звільняє оператор
Посттранскрипційна регуляція	У єукариот тільки частина РНК, що утворюється в ядрі попадає в цитоплазму. У процесингу цілком руйнується більша або менша частина синтезованих молекул
Регулювання трансляції	Регуляція трансляції відбувається на етапі ініціації за допомогою факторів ініціації

Для того щоб природні індуктори зробити менш доступними ензиматичному розщепленню, вони можуть бути модифіковані за рахунок приєднання до них полімерів або жирних кислот.

Неодмінною умовою прояву активності ферменту повинна бути здатність індукторів проникати в клітини.