Тема т4. Основні закономірності культивування мікроорганізмів та отримання продуктів мікробного синтезу
Найважливішим завданням будь-якого біотехнологічного процесу є розробка й оптимізація науково-обгрунтованої технології й апаратури для нього. При організації біотехнологічних виробництв частково був запозичений досвід развитой на той час хімічної технології.
Однак біотехнологічні процеси мають істотні відмінністі від хімічних у силу того, що в біотехнології використають більше складну організацію матерії - біологічну. Кожен біологічний об'єкт (клітина, фермент і т.д. ) - це автономна саморегулююча система.
Природа біологічних процесів складна й далеко не з'ясована детально. Для мікробних популяцій, наприклад, характерна істотна гетерогенність по ряду ознак - вік, фізіологічна активність, стійкість до впливу несприятливих факторів середовища. Вони також підлягають впливу випадковим мутаціям, частота яких становить від 10-4 до 10-8. Гетерогенність також може бути обумовлена наявністю поверхні розподілу фаз і неоднорідністю умов середовища.
Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів у загальному виді може бути представлена блок-схемою, у якій зроблена спроба охопити всі варіанти ферментаційних процесів (рис. 4.1).
1 - реактор для готування середовищ, 2 - вихровий насос, 3 - апарат для готування твердих середовищ, 4 - парова колона для підігріву середовищ до температури стерилізації, 5 - витримувач середовищ при температурі стерилізації, 6 - теплообмінник для охолодження середовищ, 7 - мірник - збірник поживного середовища 8 - дозатор, 9 - анаеробний ферментер, 10 - глибинний аеробний ферментер, 11 – біокаталітичний реактор, 12 - ферментер для поверхневої твердофазной ферментації, 13 - те ж для поверхневої рідинної ферментації, 14 - екстрактор, 15 - сепаратор для відділення біомаси, 16 - система локальної автоматики, 17 - плазмолізатор біомаси, 18 - дезінтегратор біомаси, 19 - випарна установка, 20 - фракціонування дезінтегратів, 21 - сушарка й інші апарати для зневоднювання, 22 - апаратури для розфасовки продукту, 23 - іонообмінні колони, апарати для хімічних і мембранних методів виділення, центрифуги, фільтри, кристаллизаторы й ін. пристрою. Умовні позначки: рН - розчин для корекції рН, П - компоненти й середовища для підживлення, Пос - посівний матеріал, В - стиснене повітря, ПАР - піногасник, Ср - стерильне поживне середовище БА - біологічний агент.
Рисунок 4.1 - Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів
У загальному виді будь-який біотехнологічний процес включає три основні стадії: предферментаційну, ферментаційну й постферментаційну.
На предферментаційній стадії здійснюють зберігання й підготовку культури продуцента (інокулята), одержання й підготовку поживних субстратів і середовищ, ферментаційних апаратур, технологічної й рециркулюємої води й повітря. Підтримка й підготовка чистої культури є дуже важливим моментом предферментаційної стадії, тому що продуцент, його фізіолого-біохімічні характеристики й властивості визначають ефективність усього БТ процесу. У відділенні чистої культури здійснюють зберігання виробничих штамів і забезпечують їх реактивацію й накопичення інокулята в кількостях, необхідних для початку процесу. При вирощуванні посівних доз інокулята застосовують принцип масштабування, тобто проводять послідовне нарощування біомаси продуцента в колбах, суліях (бутилях), далі в серії послідовних ферментерів. Кожен наступний етап даного процесу відрізняється за обсягом від попереднього звичайно на порядок. Отриманий інокулят по стерильній посівній лінії направляється далі в апарат, у якому реалізується ферментаційна стадія. Готування поживних середовищ здійснюється у спеціальних реакторах, обладнаних мішалками. Залежно від розчинності й сумісності компонентів середовищ можуть бути застосовані окремі реактори. Технологія готування середовищ значно ускладнюється, якщо в їх склад входять нерозчинні компоненти. У різних БТ процесах застосовуються різні по походженню й кількостям субстрати, тому процес їх готування варіює. Тому дозування поживних компонентів підбирається й здійснюється індивідуально на кожнім виробництві відповідно до технологічного регламенту конкретного процесу.
Стадія ферментації є основною стадією в БТ процесі, тому що в її ході відбувається взаємодія продуцента із субстратом й утворення цільових продуктів (біомас, ендо- і екзопродуктів). Ця стадія здійснюється в біохімічному реакторі (ферментері) і може бути організована залежно від особливостей використовуваного продуцента й вимог до типу і якості кінцевого продукту різними способами. Ферментація може проходити в строго асептичних умовах і без дотримання правил стерильності (так називана "незахищена" ферментація); на рідкі й на твердих середовищах; анаеробно й аеробно. Аеробна ферментація, у свою чергу, може протікати поверхово або глубинно (у всій товщі поживного ) середовища.
Культивування біологічних об'єктів може здійснюватися в періодичному й проточному режимах, напівбезперервно з підживленням субстратом. При періодичному способі культивування ферментер заповнюється вихідним поживним субстратом та мікроорганізмами із інокуляту.
Рисунок 4.2 – Схема біореактора періодичної дії
Протягом певного часу в апараті відбувається взаємодія мікроорганізмів із субстратом, яке супроводжується утворенням продукту (Х + S → P) (рис.4.2).
Біохімічні перетворення в цьому апараті тривають від десятків годин до декількох доби. Регуляція умов усередині ферментера - найважливіше завдання періодичного культивування мікроорганізмів. У ході періодичної ферментації культура проходить ряд послідовних стадій: лаг-фазу, експонентну, уповільнення росту, стаціонарну й відмирання. При цьому відбуваються істотні зміни фізіологічного стану біооб’єкту, а також ряду параметрів середовища. Цільові продукти утворяться в експонентній (первинні метаболіти - ферменти, амінокислоти, вітаміни) і стаціонарної (вторинні метаболіти - антибіотики) фазах, тому залежно від цілей БТ процесу в сучасних промислових процесах застосовують принцип диференційованих режимів культивування. У результаті цього створюються умови для максимальної продукції того або іншого цільового продукту. Періодично ферментер спорожняють, роблять виділення й очищення продукту, і починається новий цикл.
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні переваги перед періодичним. Безперервна ферментація здійснюється в умовах сталого режиму, коли мікробна популяція і її продукти найбільш однорідні. Застосування безперервних процесів ферментації створює умови для ефективного регулювання й керування процесами біосинтезу. Системи безперервної ферментації можуть бути організовані за принципом повного витиснення або повного змішання. Перший приклад - так називана тубулярна культура (рис.4.3).
Рисунок 4.3 – Схема турбулярного біореактора повного витіснення
Процес ферментації здійснюється в довгій трубі, у якій з одного кінця безупинно надходять поживні компоненти й інокулят, а з іншої з тією же швидкістю випливає культуральная рідина. Дана система проточної ферментації є гетерогенною.
При безперервній ферментації у ферментах повного змішання (гомогенно-проточний спосіб) у всій масі ферментаційного апарата створюються однакові умови. Застосування таких систем ферментації дозволяє ефективно управляти окремими стадіями, а також всім біотехнологічним процесом і стабілізувати продуцент у практично будь-якому, необхідному експериментаторові або біотехнологу стані. Керування подібними установками здійснюється двома способами (рис.4.4)
А-хемостат, Б –турбідостат з автоиатичною регуляцією оптичної щільності.
1 – надходження середовища; 2 – мішалка; 3 – сток культури; 4- насос; 5 – фотоелемент; 6 – джерело світла
Рисунок 4.4 – Схема біореакторів для проточного культивування мікроорганізмів
Турбидостатний спосіб базується на вимірі мутності потоку, що виходить. Вимір мутності мікробної суспензії, викликане ростом клітин, є мірою швидкості росту, з якої мікроорганізми виходять із біореактора. Це дозволяє регулювати швидкість надходження у ферментер свіжого поживного середовища. Другий метод контролю, - хемостатний, простіше. Керування процесом у хемостаті здійснюється виміром не вихідного, а вхідного потоку. При цьому концентрацію одного з компонентів поживного середовища (вуглець,кисень, азот), що поступає у ферментер, установлюють на такому рівні, при якому інші поживні компоненти перебувають у надлишку, тобто концентрація, що лімітує, обмежує швидкість розмноження клітин у культурі.
Постферментаційна стадія забезпечує одержання готової товарної продукції й також, що не менш важливо, знешкодження відходів і побічних продуктів. Залежно від локалізації кінцевого продукту (клітина або культуральная рідина) і його природи на постферментаційної стадії застосовують різні апаратури й методи виділення й очищення. Найбільш трудомістке виділення продукту, що накопичується в клітинах. Першим етапом постферментаційної стадії є фракціонування культуральної рідини й відділення зваженої фази - біомаси. Найпоширеніший для цих цілей метод - сепарації, який здійснюється в спеціальних апаратах - сепараторах, які працюють по різних схемах залежно від властивостей оброблюваної культуральнї рідини. Основні проблеми, виникають при необхідності виділення дрібнозважених часток з розміром 0.5-1.0 мкм і менш (бактеріальні клітини) і необхідністю переробки більших обсягів рідини (виробництво кормового білка, ряду амінокислот). Для підвищення ефективності процесу сепарації застосовують попередню спеціальну обробку культури - зміна рН, нагрівання, додавання хімічних агентів. Для збільшення строків придатності біотехнологічних продуктів роблять їхнє зневоднювання й стабілізацію. В залежності від властивостей продукту застосовують різні методи висушування. Сушіння термостабільних препаратів здійснюються на стрічковому конвеєрі, а також у киплячому шарі. Особливо чутливі до нагрівання препарати висушують у вакуум-сушильних шафах при зниженому тиску й температурі й у розпилюючих сушарках. До стабілізації властивостей біотехнологічних продуктів веде додавання в якості наповнювачів різних речовин. Для стабілізації кормового білка застосовують пшеничні висівки, кукурудзяне борошно, що володіють додатковою поживною цінністю. Для стабілізації ферментних препаратів використовують гліцерин і вуглеводи, які перешкоджають денатурації ферментів, а також неорганічні іони кобальту, магнію, натрію, антибіотики й ін.
Контрольні питання до теми Т4:
1. Природа біологічних процесів
2. Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів.
3. Основні стадії біотехнологічного процесу.
Тема Т5. Біологічні агенти біотехнології
Біологічний агент є активним початком у біотехнологічних процесах й одним з найбільш важливих її елементів. Номенклатура біологічних агентів бурхливо розширюється, але дотепер найважливіше місце займає традиційний об'єкт - мікробна клітина (табл. 5.1).
Мікробні клітини з різними хіміко-технологічними властивостями можуть бути виділені із природних джерел і далі за допомогою традиційних (селекція, відбір) і новітніх методів (клітинна й гене-тическая інженерія) істотно модифіковані й поліпшені. При виборі біологічного агента й постановці його на виробництво насамперед слід дотримуватися принципу технологічності штамів. Це значить, що мікробна клітина, популяція або співтовариство особин повинні зберігати свої основні фізіолого-біохімічні властивості в процесі тривалого ведення ферментації. Промислові продуценти також повинні мати стійкість до мутаційних впливів, фагам, зараженню сторонньою мікрофлорою (контамінації); характеризуватися безшкідливістю для людей і навколишнього середовища, не мати при вирощуванні побічних токсичних продуктів обміну й відходів, мати високі виходи продукту й прийнятні техніко-економічні показники.
У цей час багато промислових мікробних технологій базуються на використанні гетеротрофних організмів, а в майбутньому вирішуюче місце серед продуцентів займуть автотрофні мікроорганізми, що не потребують для росту дефіцитні органічні середовища, а також екстремофіли - організми, що розвиваються в екстремальних умовах середовища (термофільні, гало- і ацидофільні).
Особлива група біологічних агентів у біотехнології - ферменти, так названі каталізатори біологічного походження. Ферменти знаходять все більше застосування в різних біотехнологічних процессах і галузях господарювання, але до 60-х років цей напрямок стримувався труднощами їхнього одержання, нестійкістю, високої вартістю. Як окрему галузь у створенні й використанні нових біологічних агентів варто виділити іммобілізовані ферменти, які являють собою гармонійно функціонуючу систему, дію якої визначається правильним вибором ферменту, носія й способу іммобілізації. Перевага мобілізованих ферментів у порівнянні з розчинними полягає в наступному: стабільність і підвищена активність, утримання в обсязі реактора, можливість повного й швидкого відділення цільових продуктів й організації безперервних процесів ферментації з багаторазовим використанням біологічного агента. Іммобілізовані ферменти відкривають нові можливості в созданиибиологических мікропристроїв для використання в аналітику, перетворенні енергії й биоэлектрокатализе.
Таблиця 5.1 – Мікроорганізми - продуценти, які використовуються в біотехнології для одержання цільових продуктів
Організм |
Тип |
Продукт |
Saccharomyces cerevіsіae |
Дріжджі |
Пекарські дріжджі, вино, ель, саке |
Streptococcus thermophіlus |
Бактерії |
Йогурт |
Propіonіbacterіum shermanіі |
Бактерії |
Швейцарський сир |
Gluconobacterіum suboxіdans |
Бактерії |
Оцет |
Penіcіllіum roquefortіі |
Цвіль |
Сири типу рокфору |
Aspergіllus oryzae |
Цвіль |
Саке |
Saccharomyces cerevіsіae |
Дріжджі |
Етанол |
Clostrіdіum acetobutylіcum |
Бактерії |
Ацетон |
Xanthomonas campestrіs |
Бактерії |
Полісахариди |
Corynebacterіum glutamіcum |
Бактерії |
L-Лізин |
Candіda utіlіs |
Дріжджі |
Мікробний білок |
Propіonіbacterіum |
Бактерії |
Вітамін В12 |
Aspergіlus oryzae |
Цвіль |
Амілаза |
Kluyveromyces fragіlіs |
Дріжджі |
Лактаза |
Saccharomycopsіs lіpolytіca |
Дріжджі |
Ліпаза |
Bacіllus |
Бактерії |
Протеази |
Endothіa parasіtіca |
Цвіль |
Сичуговий фермент |
Leocanostoc mesenteroіdes |
Бактерії |
Декстран |
Xanthomonas campestrіs |
Бактерії |
Ксантан |
Penіcіllіum chrysogenum |
Цвіль |
Пеніциліни |
Chehalosporіum acremonіum |
Цвіль |
Цефалоспирини |
Rhіzopus nіgrіcans |
Цвіль |
Трансформація стероїдів |
E. colі (рекомбінантні штами) |
Бактерії |
Інсулін, гормон росту, інтерферон |
Blakeslea trіspora |
Цвіль |
β-Каратин |
Phaffіa rhodozyma |
Дріжджі |
Астаксантин |
Bacіllus thurіngіensіs |
Бактерії |
Біоінсектециди |
Bacіllus popіllіae |
Бактерії |
Біоінсектециди |
До нетрадиційних біологічних агентів на даному етапі розвитку біотехнології відносять рослинні й тваринні тканини, у тому числі гібридоми, трансплантанти. Велика увага в цей час приділяється одержанню новітніх біологічних агентів - трансгенних клітин мікроорганізмів, рослин, тварин генноінженерними методами. Розвинені також нові методи, що дозволяють одержувати штучні клітини з використанням різних синтетичних і біологічних матеріалів (мембрани із заданими властивостями, ізотопи, магнітні матеріали, антитіла). Розробляються підходи до конструювання ферментів із заданими властивостями, що мають підвищену реакційну активність і стабільність. У цей час реалізований синтез поліпептидів бажаної стереоконфігурації й ін.
Таким чином, у біотехнологічних процесах можливо використання різних біологічних агентів з різним рівнем організації, - від клітинної до молекулярної.
Контрольні питання до теми Т5
1. Назвіть продуценти наступних продуктів: Пекарські дріжджі, Швейцарський сир, Оцет, L-Лізин, Вітамін В12.
2. Як проводиться підбір продуценту для певного виробництва?
3. Як проводиться селекція штамів продуцентів?