Біотехнологія одержання гормонів Одержання інсуліну.

• 2% населення Землі хворі на діабет

• 20% хворих на діабет потребують ін’єкцій інсуліну

• З усіх людей віком 8-12 років 0,25% хворі; 40-50 років - 3%; старші 70 років -7%.

• Діабет займає третє місце після серцево-судинних і онкологічних захворювань.

• Перші досліди по використанню інсуліну для лікування проведені у 1922 році.

Отримання інсуліну з природної сировини

Недоліки:

1. Обмеженість сировини (підшлункової залози).

2. При ін’єкціях інсуліну виділеного з підшлункової залози корови в організмі виробляються антитіла до цього інсуліну, які інактивують його, тобто зменшується тривалість біологічної дії препарату.

3. В таких препаратах є домішки інших білків які теж викликають утворення антитіл, тому в місці повторного введення препарату атрофується підшкірний жировий прошарок.

Хімічний синтез інсуліну

1963 рік ФРН, США, Китай

Недоліки:

1) Трудомісткий (близько 170 реакцій). 2) Важко було синтезувати дисульфідні зв’язки, тому спочатку синтезували проінсулін.

Інформація про структуру інсуліну закодована в 11 хромосомі.

Поліпептид А – 63 пари основ. Поліпептид В – 90 пар основ.

Отримання інсуліну з використанням рекомбінантних ДНК.

Перші досліди 1979 рік. Широке виробництво 1981 рік.

Eli Lilly and Co. спільно з Genentech. Inc.

1. Окремий синтез генів що кодують поліпептиди (ланцюги) А і В (послідовність ДНК відтворили по амінокислотній послідовності інсуліну).

2. Вбудовування кожного гена в середину гена β-галактозидази плазміди.

3. Введення плазмід в клітину E.coli.

4. Клітини вирощують на середовищі з лактозою і в них індукується синтез β-галактозидази (цей ензим розщеплює лактозу на галактозу і глюкозу). Разом з β-галактозидазою синтезуються поліпептиди А і В приєднані до неї через залишки метіоніну.

5. Лізис бактерій і обробка бромціаном (N≡C-Br), що розщеплює білки специфічно по залишку метіоніну. Інсулін метіоніну не має і тому його поліпептиди не зруйнуються, а зруйнується β-галактозидаза.

6. Очистка поліпептидів А і В та їх об’єднання.

7. Створення дисульфідних зв’язків, для об’єднання поліпептидів А і В, було складне, тому синтезували проінсулін, який потім β-карбоксипептидазою розщепили до інсуліну.

1. Виділення з β-клітин острівців Лангерганса м-РНК, яка кодує структуру проінсуліну.

2. Синтез комплементарної ДНК на М-РНК методом зворотної транскрипції.

3. На отриманому ланцюзі ДНК синтез іншого ланцюга ДНК і отримання гену проінсуліну.

4. Нарощування на кінцях гена тетрануклетидів цитидилу “липкі кінці”.

5. Розрізання рестриктазою гена пеніцилінази (цей ензим відповідає за стійкість до пеніциліну) в плазміді PBR-382.

6. Нарощування гуанілових “липких кінців” на розрізаних кінцях гена плазміди.

7. Вмонтовування гена проінсуліну в плазміду.

8. Введення плазміди в E.coli.

9. Синтез проінсуліну геном, який до модифікації синтезував пеніциліназу.

10. Обробка проінсуліну трипсином для відщеплення С-пептиду.

Між С-кінцями В-ланцюгів інсуліну формуються водневі зв’язки і утворюються димери інсуліну, які в присутності йонів цинку формуюють гексамери.

Мономери і димери легко дифундують в кров, а гексамери погано.

Інсулін-ліспро – перший рекомбінантний аналог інсуліну. В ньому поміняні місцями залишки лізину і проліну. Це зменшило формування димерів і гексамерів і не вплинуло на зв’язування гормону з рецепторами.