Генна інженерія

План

1. Будова нуклеїнових кислот.

2. Структура гена еукаріот.

Нуклеотиди:

Основа (пуринова або піримідинова)

Пентоза (дезоксирибоза або рибоза)

Фосфорна кислота (від 1 до 3 залишків)

1. Нуклеотиди з’єднані естерним зв’язком між фосфатним залишком (знаходиться біля 5’ вуглеця пентози) одного нуклеотида і ОН-групою (знаходиться біля 3’ вуглеця пентози) іншого нуклеотида.

2. На одному кінці ланцюга є вільна фосфатна група – 5’ кінець, а на іншому кінці ланцюга є вільна ОН-група – 3’ кінець.

Правила Чаргаффа: А – Т; Ц – Г

Транскрипція – синтез РНК “на” ДНК.

Реплікація (редуплікація) ДНК – синтез ДНК “на” ДНК.

Трансляція – синтез поліпептидів “на” м-РНК (і-РНК).

Ген (цистрон) – ділянка ДНК, яка кодує один поліпептидний ланцюг.

Локус – ділянка молекули ДНК на якій знаходяться гени чи регуляторні ділянки.

Кодон – послідовність трьох нуклеотидів. Кожний кодон кодує певну амінокислоту або є сигнальним.

Геном людини складається з 3 000 000 000 пар основ. 20 000-25 000 генів.

Регуляторні гени контролюють транскрипцію.

Структурні гени визначають амінокислотну послідовність білків.

Оперон – ділянка ДНК, яка включає регуляторні та структурні гени.

Промотор – ділянка ДНК з якою зв’язується РНК-полімераза та ініціюється транскрипція (є РНК-полімерази І (А), ІІ (В) та ІІІ (С) – транскрипція генів рРНК, більшості генів та тРНК відповідно). Знаходиться на початку оперона.

Оператор – ділянка ДНК, з якою зв’язується білок репресор в результаті чого блокується транскрипція (якщо репресор не зв’яжеться, то транскрипція відбудеться). Знаходиться після промотора і перед структурними генами. Синтез репресора контролює регуляторний ген, який знаходиться безпосередньо перед опероном, або на певній відстані від нього.

Екзони – ділянки ДНК, які транскрибуються в про-і-РНК та знаходяться в і-РНК.

Інтрони – ділянки ДНК, які транскрибуються в про-і-РНК, але в процесі сплайсингу видаляються і тому відсутні в і-РНК.

Сплайсинг – посттранскрипційна модифікація про-і-РНК, при якій інтрони видаляються, а екзони об’єднуються в і-РНК.

Термінатор – ділянка ДНК, яка відповідає за припинення транскрипції. Знаходиться на кінці транскрипта.

Оперон еукаріот має складний за будовою промотор та екзон-інтронну почерговість структурних генів.

Оперон прокаріот має простіший за будовою промотор та не має інтронів.

ОТРИМАННЯ ГЕНІВ

• Трансдукція – перенесення генетичного матеріалу в клітину при допомозі вірусного вектора.

• Сайт – нуклеотидна послідовність в нуклеїновій кислоті (ділянка нуклеїнової кислоти).

• Праймер – олігорибонуклеотид, який містить від 4 до 10 нуклеотидних залишків.

• Праймаза – РНК-полімераза.

• Плазміди – подвійні замкнені в кільце спіралі ДНК з одним, або кількома генами (іноді і без генів). Виявлені в бактеріях (цитоплазма), дріжджах та мітохондріях еукаріотичних клітин. Вони функціонують незалежно від решти генетичного матеріалу, переходять з однієї клітини в іншу. Деякі бактеріальні плазміди можуть включатись в геном і знову відділятись.

• Епісома – плазміда, яка включається в хромосому клітини і утворює ковалентно-зв’язану структуру.

• Бактеріофаги – віруси, які розмножуються в бактеріях.

• Вектор – молекула ДНК, яка здатна до автономної реплікації і включення чужорідної ДНК.

• Бактеріальні плазміди і епісоми, бактеріофаг λ, деякі онкогенні віруси – це вектори.

Методи отримання генів:

• Хімічний синтез генів.

• Ферментативний синтез генів.

• Виділення генів з природного матеріалу.

Хімічний синтез генів

• Суть методу: структуру гена встановлюють на основі розшифрованої первинної структури білка чи РНК які кодуються цим геном.

• Вперше у 1969 році в США здійснив індійсько-американський біофізик Hara Corana (народився 9 січня 1922 року у селі Райпура провінція Пенджаб в той час Індія, тепер Пакистан).

Синтезували ген, який кодує структуру аланінової т-РНК пекарських дріжджів:

1. Встановили послідовність нуклеотидів в гені на основі послідовності нуклеотидів в т-РНК;

2. Синтезували фрагменти довжиною 4-13 нуклеотидних пар;

3. З’єднали окремі фрагменти за допомогою Т4-полінуклеотидлігази (виділена з фага Т4);

4. Отримали ген довжиною 77 нуклеотидних пар, але він був неактивний, бо не мав регуляторних ділянок (промотора і термінатора).

У 1976 році у цій же лабораторії синтезували ген тирозинової т-РНК:

1. Довжина 126 пар нуклеотидів, сюди входили промотор (52 пари) і термінатор (21 пара).

2. До кінців гена були прикріплені “липкі” кінці ААТТ і ТТАА.

3. Цей ген вмонтували в геном бактеріофагу λ і потім ввели в бактеріальну клітину.

Недоліки отримання генів методом хімічного синтезу:

• Сам метод трудомісткий;

• Розшифровка генів еукаріот ускладнена їх екзон-інтронною будовою.

• Великі за розміром гени складно синтезувати.

Ферментативний синтез генів

ДНК ↓ РНК ↓ Білок

ДНК ↕ РНК ↓ Білок

• У 1970 році в онкогенних вірусах відкрили фермент зворотну транскриптазу (ревертазу), за допомогою якого ДНК транскрибується з молекул і-РНК.

У 1972 році (США) отримали ділянку ДНК, що була геном глобіну кроля:

1. Виділяють молекули і-РНК необхідного гена.

2. На 3’-кінці така молекула і-РНК має кілька аденілових нуклеотидів. До них приєднують ще кілька таких нуклеотидів.

3. Вносять “затравки” – олігонуклеотиди тиміну (комплементарні аденіловим), які ініціюють процес утворення пар А-Т.

4. В середовище вносять дезокситрифосфати (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) та фермент зворотню транскиптазу (виділена з віруса пташиного міобластозу) – проходить зворотне транскрибування.

5. Після завершення транскрипції ланцюга ДНК на матриці і-РНК, отриманий комплекс ДНК-і-РНК обробляють лугом або РНК-азою, щоб звільнити ланцюг ДНК.

6. На одному ланцюзі ДНК здійснюють комплементарний синтез другого ланцюга ДНК (процес аналогічний реплікації).

Недоліки ферментативного синтезу генів

• Отриманий таким чином ген не є повноцінний, бо не має регуляторних ділянок (промотора і термінатора) та інтронів, оскільки в і-РНК немає інформації про ці частини гена.

• Промотор і термінатор синтезують хімічним способом і приєднують до гена.

• Щоб в гені були інтрони треба виділити не і-РНК, а про-і-РНК, яка не пройшла сплайсингу і містить інтрони.

Виділення генів з природного матеріалу

• Суть методу – з клітин виділяють ДНК і фрагментують її ензимами для виділення генів.

• У 1972 році відкрили рестриктази.

• Рестрикційні ендонуклеази (рестриктази) – це бактеріальні ензими, які розщеплюють ДНК яка потрапляє в бактеріальну клітину з вірусами (захисна дія). До 1985 року індентифікували 100 рестриктаз, сьогодні – близько 400.

• Дію рестриктаз нейтралізують метилази, які метилюють азотисті основи (рестриктази не розщеплюють метильовані сайти).

Рестриктази розщеплюють ДНК з утворенням двох типів кінців:

1. Рестриктаза E.coRI (виділена з E.coli) специфічна до зв’язків А і Г. Вона розщеплює ДНК на фрагмети з одноланцюговими послідовостями які є “липкими” кінцями.

2. Рестриктаза HaeIII (виділена з Haemophilus aegypticus) специфічна до зв’язків Г і А. Вона розщеплює ДНК залишаючи “тупі” кінці.

Недоліки методу виділення генів з природного матеріалу:

• Важко точно “вирізати” ген з ДНК, тобто залишаються зайві нуклеотиди, які заважають наступному використанню генів, або може бути відсутня необхідна частина гена.

• Якщо ген дуже малий, то його складно виділити з отриманої суміші.

• Краще застосовувати для генів прокаріот, що не мають екзон-інтронної (в генів еукаріот) будови, яка ускладнює їх дію.

Рекомбінантні ДНК

• Рекомбінація – обмін генетичним матеріалом між двома вихідними (батьківськими) молекулами ДНК.

Одержання рекомбінантних ДНК:

1. Однією рестриктазою розщеплюють ДНК з якої добувають ген (отримують ген з двома липкими кінцями) і ДНК вектора (отримують вутор з двома липкими кінцями).

2. ДНК-лігазами (які каталізують утворення естерних зв’язків між 3’-ОН-групами і 5’-Р-групами) з’єднують кінці векторної ДНК з кінцями гена. Можна також хімічно синтезувати фрагменти з 6-10 пар основ (лінкери) і ними з’єднати кінці векторної ДНК з кінцями гену.

3. Вводять таку рекомбінантну ДНК в бактеріальну клітину E.coli, де буде проходити реплікація – відтворення ідентичних рекомбінантних ДНК.

4. Контролюють експресію необхідних генів.

insulin for diabetics; factor VIII for males suffering from hemophilia A; factor IX for hemophilia B; human growth hormone (GH); erythropoietin (EPO) for treating anemia; three types of interferons; several interleukins; granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) for stimulating the bone marrow after a bone marrow transplant; granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) for stimulating neutrophil production, e.g., after chemotherapy and for mobilizing hematopoietic stem cells from the bone marrow into the blood; tissue plasminogen activator (TPA) for dissolving blood clots; adenosine deaminase (ADA) for treating some forms of severe combined immunodeficiency (SCID); angiostatin and endostatin for trials as anti-cancer drugs; parathyroid hormone; leptin; hepatitis B surface antigen (HBsAg) to vaccinate against the hepatitis B virus; C1 inhibitor (C1INH) used to treat hereditary angioneurotic edema (HANE)