Біотехнологія

• Загальна біотехнологія:

1. Клітинна інженерія.

2. Генетична інженерія.

• Спеціальна біотехнологія:

1. Отримання антибіотиків.

2. Отримання вакцин.

3. Отримання гормонів.

4. Іммобілізовані ферменти.

5. Інтерферони.

6. Отримання амінокислот і білків.

7. Отримання вітамінів.

8. Переробка відходів.

Клітинна інженерія

План

1. Характеристика будови клітин. Клітинний цикл.

2. Культури клітин.

3. Гібридоми. Моноклональні антитіла.

4. Клонування організмів.

Культури клітин

План

1. Характеристика будови клітин. Клітинний цикл.

2. Культури клітин.

• Клітини прокаріот (бактерії та синьо-зелені водорості) не мають чітко оформленого ядра.

• Клітини еукаріот (клітини рослин та тварин) мають ядро.

Будова клітини

• Клітина оточена плазматичною мембраною, всередині є протоплазма яка включає ядро (зберігає генетичну інформацію) та цитоплазму. В цитоплазмі містяться органели: мітохондрії (забезпечують клітини енергією), рибосоми (синтез білка), лізосоми (містять гідролітичні ферменти), комплекс Гольджі (сітка розташована навколо ядра, тут проходить посттрансляційна модифікація білків), ендоплазматична сітка (розгалужена система каналів на яких проходять синтетичні процеси, виведення продуктів обміну, утворення органел), пероксисоми (містять ферменти, які розщеплюють Н2О2).

Клітинний цикл

• Проміжок часу між закінчення поділу клітини і до початку нового поділу (мітотичний цикл).

• Клітинний цикл поділяється на: 1) мітоз; 2) інтерфазу.

Інтерфаза поділяється на:

• Пресинтетичний (постмітотичний) період G1 – триває від закінчення мітозу і до початку подвоєння ДНК. Клітина росте і в ній синтезуються РНК, ферменти, структурні білки, макроергічні сполуки, здійснюється транспорт глюкози та амінокислот в клітину.

• Синтетичний період S – подвоюється ДНК, збільшується синтез гістонових білків.

• Постсинтетичний (премітотичний) період G2 – нагромадження енергії та синтез сполук необхідних для здійснення поділу клітини.

Клітинний цикл для клітин HeLa становить 23 год:

G1 – 12 год,

S – 5 год,

G2 – 5 год,

М (мітоз) – 1 год

Тканинна культура

1. Клітини можуть певний час жити поза організмом.

2. Клітини можуть окремо жити і розмножуватись після міграції з фрагменту тканини в культуральне середовище.

Переваги клітинних культур над тканинними:

1. Розмножуються.

2. Можна заморозити і зберігати.

1955 Рік Ігл описав середовища Ігла до складу якого входять компоненти необхідні для існування клітин тварин в умовах in vitro

Культура клітин (клітинна культура) – культура роз’єднаних клітин, яка здатна більше 24 годин підтримувати життєдіяльність в умовах in vitro

Культури клітин отримують:

1. Ембріональних тканин. Вони краще ростуть і виживають ніж культури з тканин дорослих організмів.

2. Тканин дорослих організмів.

Культури клітин з нормальних тканин:

1. Обмежений період життя.

2. В умовах in vitro погано проліферують (окремі лінії нормальних клітин в умовах in vitro необмежено довго проліферують – MDCK з нирки собаки).

3. Як правило не диференціюють, а якщо і диференціюють то припиняється проліферація.

Культур клітин з пухлин:

1. В умовах in vitro необмежено проліферують.

2. Здатні частково диференціювати із збереженням проліферації.

3. Їх можна пасажувати на сингенних господарях для добування великої кількості (така популяція недостатньо гомогенна).

4. Первинна культура клітин – культура, клітини якої взяті безпосередньо з організму (не піддавалась навіть одноразовому пасажуванню).

5. Пасажована культура (субкультура) – культура клітин, яка хоча б один раз пересіяна (перенесена з однієї посудини в іншу).

6. Клітинна лінія – культура клітин, яка виникає з первинної культури починаючи з першого пасажу.

7. Постійна клітинна культура (лінія) – лінія, яка здатна витримати необмежену кількість пасажів (“безсмертна” клітинна культура).

8. Клітинний штам – культура, клітини якої володіють характерними ознаками (маркерами) і виділені клітини за цими характерними ознаками (стійкість до вірусу, вироблення специфічного антигена, підвищена активність фермента).

Етапи отримання та культивування клітин:

1. Отримання тканин.

2. Дезагрегація тканин: а) осмотичний метод; б) ферментативний метод.

3. Адгезія клітин до субстрату: а) клітини які можуть проліферувати в культуральному середовищі в суспензії не прикріпляючись до субстрату (деякі пухлинні клітини, клітини імунної системи, кісткового мозку та ін.); б) клітини які повинні бути прикріплені до субстрату (більшість нормальних клітин ссавців та ін.)

4. Інкубація клітин: а) лаг-період (1-1,5 годин); б) стадія логарифмічного росту (4-5 діб); в) стадія плато (через 7 днів після висіву).

Середовища для інкубування клітин:

1. Неорганічні солі які є: а) компоненти буферних систем, б) підтримують осмотичний тиск, в) макро- та мікроелементи.

2. Індикатори для контролю рН.

3. Амінокислоти, вітаміни, глюкоза живлення.

4. Антибіотики – пригнічення росту мікрофлори.

5. Сироватка крові: а) забезпечує клітини гормонами і гормоноподібними факторами росту, б) містить фактори необхідні для прикріплення клітин in vitro, в) має транспортні білки.

Синхронізація клітин у культурі:

• Селективний метод (мітотичні клітини округлої форми і менші за розміром, тому при струшуванні легко відділяються від субстрату)

• Індуктивні методи:

1. Інгібітори (тимідин, аміноптерин та ін. блокують окремі життєво важливі метаболічні процеси)

2. “Голодування” клітин (клітини які голодують зупиняться на стадії G₁, інші загинуть).