В процесах органогенезу і соматичного ембріоїдогенезу
5.2. Утворення соматичних ембріоїдів
Тотипотентність дедиференційованих калусних клітин обумовлює їх здатність в певних умовах повертатися до ембріонального стану і давати початок рослинам-регенерантам. Таке перетворення відбувається після перенесення невеличких частин калусних тканин на середовище з рівним співвідношенням ауксин/цитокінін, а потім – на середовище без фітогормонів. Відпрацювання методики одержання ембріогенного калусу та індукції ембріоїдів обов’язково передбачає підбір середовища і вибір експлантат для конкретного виду або сорту рослин. Найбільш компетентними для індукції соматичного ембріоїдогенезу є молоді тканини рослин. Крім того, перші пасажі калусних культур мають більш високий морфогенетичний потенціал, який поступово втрачається при тривалому культивуванні.
Е
лектронномікроскопічні
спостереження за процесом формування
ембріоїдоподібних структур на калусній
масі свідчать, що спершу з’являються
бугорчасті утворення, подібні до апексів.
Як правило, ембріоїди проходять три
стадії розвитку: глобулярну, серцеподібну
і торпедоподібну (рис. 2).
Рис. 2. Стадії розвитку соматичного ембріоїда:
1 – глобулярна, 2 – серцеподібна, 3 - торпедоподібна
Соматичні ембріоїди легко (вільно) відокремлюються від калусної маси і пересаджуються на інше поживне середовище для одержання з них рослин-регенерантів. Ембріоїди виникають з поверхневих клітин і мають одноклітинне походження. Ембріогенні клітини відрізняються більш щільною цитоплазмою, відносно великим ядром і значною кількістю рибосом. Відмічають також, що перетворення калусної клітини в ембріогенну супроводжується перерозподілом у ній мікротрубочок: хаотичне розміщення мікротрубочок змінюється на їх лінійну орієнтацію паралельно осі клітини.
Таким чином, походження зародкоподібних структур серед клітин калусної тканини не пов’язане з мейозом та подвійним заплідненням.
5.3. Сомаклони. Природа сомаклональної мінливості
Рослини-регенеранти, які одержані шляхом соматичного ембріоїдогенезу, називають сомаклонами (синонім – сомаклональними варіантами). Р.Чалеф у 1981 р. запропонував символ R для рослин-регенерантів, одержаних з культур клітин або тканин (незалежно від тканини або походження). Самозапилені нащадки рослини R0 позначаються R1; наступні покоління від самозапилення – R2, R3 і т.д. Це пояснюється необхідністю прийняття універсальної номенклатури для регенерантів і проведення генетичного аналізу їх нащадків (аналогічно, як символ F використовується при статевій гібридизації, M – при мутагенезі). Поява сомаклонів, що мають генетичні відмінності від материнської рослини, обумовлена існуванням сомаклональної мінливості. Це явище було відкрите на початку 80-х років і вважається одним із перспективних напрямів індукції мінливості в культурі ін вітро. Невизначеність генотипів ембріоїдів, з яких утворюються сомаклональні варіанти, обумовлює їх потенційну цінність для поліпшення існуючих сортів рослин.
Природа виникнення сомаклональної мінливості пояснюється двома основними причинами:
генетична гетерогенність соматичних клітин експлантат вихідної рослини;
генетична і епігенетична мінливість, що індукується умовами культивування.
Перша причина пов’язана з генетичним різноманіттям соматичних клітин рослин у природі (різний рівень плоїдності, химеризм). В клітинах меристемних тканин рослин на різних етапах онтогенезу може відбуватися ендореплікація хромосом і формування тканин з різним рівнем плоїдності. Міксоплоїдія і химеризм особливо часто зустрічаються в апоміктичних і вегетативно розмножуваних рослин. Химерні тканини складаються з генетично неоднорідних клітин, які можуть різнитися ядерними генами, числом хромосом, генами пластид або мітохондрій.
Існує класифікація типів химерних тканин рослин:
Мозаїчні (гіперхимерні) – генетично різні тканини утворюють мозаїчну структуру.
Секторіальні – різнорідні тканини розташовані окремими великими ділянками.
Периклинальні – тканини розташовані одна над одною.
Мериклинальні – суміш секторіальних і периклинальних ділянок тканин.
Прикладами химеризму можуть служити характер забарвлення, строкатість листя пеларгонії і хлорофітуму, що обумовлено різним числом шарів меристем точки росту, які приймають участь в утворенні листка.
Химеризм, міксоплоїдія, спонтанні поліплоїди виникають в результаті природних або штучних мутацій, а вегетативне розмноження зберігає набуті зміни в рослинах-регенерантах. Хромосомні перебудови спостерігаються також при зміні умов вирощування (підвищені або понижені температури, високі дози мінеральних добрив, засолення, поранення, пестициди та ін.), які призводять до фізіологічних порушень і аномальних мітозів.
Таким чином, генетична гетерогенність соматичних клітин експланту материнської рослини є однією з причин сомаклональної мінливості і обґрунтовує ймовірність виникнення нових генотипів сомаклонів.
Пояснювати природу сомаклональної мінливості ін вітро можна також з позицій генетичних перетворень в системі експлант-калус-презародок. Численні цитологічні і біохімічні дослідження підтверджують, що в основі сомаклональних варіацій знаходяться зміни, які відбуваються в калусних клітинах і призводять до їх генетичної неоднорідності. Механізми цих процесів класифікують за такими категоріями:
очевидні зміни каріотипу;
поодинокі мутації генів;
перебудови хромосом або генів (у тому числі мітотичний кросинговер);
пересування мобільних генетичних елементів;
мінливість поза ядерних генів (цитоплазмону).
Вирішальну роль у регуляції вищеназваних процесів ін вітро відіграють фітогормони поживного середовища. Порушення фітогормонального балансу (ауксин/цитокінін) впливає на тип морфогенезу, змінює мітотичний процес і призводить до змін у хромосомах ядра.
Виявлені перебудови у мітохондріальних і хлоропласт них ДНК сомаклонів деяких рослин, які відрізнялися за фенотипом. Особливо це стосується виникнення альбінос них сомаклональних варіантів, що вказує на значну роль цитоплазми при поясненні природи хлорофільних мутацій.
Результати досліджень виникнення сомаклональних варіантів ін вітро підтверджують, що різні фізичні і хімічні фактори (температура, випромінювання, дисбаланс регуляторів росту, хімічні агенти тощо) спочатку викликають фізіологічні зміни в клітинах (порушення мітозу, мейозу, типу морфогенезу), що приводить клітини до передмутаційного стану. Повернення до нормального стану усувається за рахунок тотожного відновлення (репарації) або реалізується у вигляді мутацій (нетотожнє відновлення).
Частота виникнення сомаклональних варіантів не перевищує 4-6%. З метою збільшення частоти і розширення спектру сомаклональної мінливості використовують мутагени (N-нітрозометилсечовину, 1,4-біс-діазоацетилбутан та ін.).