4.3.1. Діагностика вірусів за допомогою електронної мікроскопії

Форма і величина вірусів – надійний критерій їх ідентифікації за допомогою електронної мікроскопії. Електронний мікроскоп, що збільшує об’єкт у десятки тисяч разів, дозволяє побачити віруси, розміри яких коливаються в межах 20-450 нм (1 нм = 10^-9 м). Існують такі методи електронного мікроскопіювання:

• негативного контрастування;

• занурення;

• імуносорбентної електронної мікроскопії;

• інфрачервоної електроскопії;

• люмінесцентного аналізу.

Метод негативного контрастування. Листок рослини мацерують (подрібнюють) на склі в краплі контрастера (розчин фосфорно-вольфрамової кислоти – ФВК, рН 7,4 або 2% розчин уранілацетату, рН 7,4), а потім цю краплю наносять на сітку-підкладку, на якій витримують 2-3 хв. і відтягують фільтрувальним папером. Препарати висушують на повітрі і розглядають в електронному мікроскопі.

Метод занурення використовують для виявлення паличко- і ниткоподібних вірусів. Листок зрізують і місце зрізу на 1-2 сек. Занурюють у краплю дистильованої води, яку попередньо наносять на сітку-підкладку. Після висихання краплі препарат контрастують розчином ФВК або уранілацетату при експозиції 5-10 хв.

Метод імуносорбентної електронної мікроскопії дає можливість збільшити концентрацію вірусів на сітці-підкладці і підвищити достовірність аналізу. Сітки з гідрофільною плівкою (розведення антисироватки 1:10 або 1:100 в 0,1 М буферному розчині, рН 7) інкубують у вологій камері протягом 5-10 хв. при кімнатній температурі. При цьому білки антитіл сироватки сорбуються речовиною плівки-підкладки. Протеїни сироватки, що не адсорбувалися, видаляють промиванням сіток краплями буферу (трис-буфер 0,05 М, рН 7,2). Після цього на сітки-підкладки наносять краплю соку хворої рослини, інкубують протягом 10-20 хв., а потім промивають 2-3 рази 0,4 М розчином сахарози і дистильованої води для видалення решток клітин. Сітки висушують на повітрі. Вірусні частки контрастують протягом 2-5 хв. водним розчином уранілацетату в концентрації 2%, потім розглядають в електронному мікроскопі. Якщо спостерігаються змішані інфекції, аналіз повторюють, чергуючи діагностичні сироватки.

Метод інфрачервоної електроскопії. В його основі лежать біохімічні зміни, які відбуваються в клітинах і тканинах під дією вірусної інфекції, що проявляється в трансформаціях спектру інфрачервоної зони поглинання, яка відображає атомно-молекулярну структуру об’єкту. При цьому порівнюють спектри інфрачервоного поглинання хворих і здорових листків рослини.

Листок рослини закріплюють стандартним закріплювачем твердих зразків, що є в комплекті кожного інфрачервоного спектрометра. Після цього проводять реєстрацію (запис) спектру інфрачервоного поглинання зразка в спектральній області (у межах 850-1750 см^-1), яка є відповідною поглинанню білків і нуклеїнових кислот, що індукуються вірусною інфекцією. Зареєстрований при цьому спектр порівнюють із спектром інфрачервоного поглинання листка здорової рослини (стандарт). Про наявність або відсутність вірусної інфекції свідчать подібність або розбіжність характеристик спектрів інфрачервоного поглинання дослідного і стандартного зразка у даній області.

Метод люмінесцентного аналізу ґрунтується на явищі первинного і вторинного світіння уражених вірусами тканин рослин в ультрафіолетовому світлі, джерелом якого може бути освітлювач 01-18 із світлофільтром УФС-3.

Люмінесцентний метод можна застосовувати як допоміжний метод встановлення вірусної природи некрозу при локальній реакції на вірус, особливо якщо ці некрози дуже малі або на листках багато механічних пошкоджень.