4.2.1. Поєднання методу верхівкових меристем із термотерапією

Окремі фізичні і хімічні фактори мають стимулюючу або пригнічуючи дія на віруси, а також на рослини, у яких вони репродукуються. До цих факторів належать температура, різні види випромінювання, постійне магнітне поле, рН середовища, деякі хімічні речовини.

Термотерапія рослин – один із ефективних методів профілактики і лікування вірусних захворювань. Піонером застосування термотерапії для лікування рослин вважають П.Кобуса, який у 1889 році використав гарячу воду проти вірусного захворювання цукрової тростини. Новий етап у розвитку термотерапії почався у 1935 році, коли американець Л.Кункель застосував гаряче повітря для лікування персика від жовтухи, дрібноплодності і розеточності.

Різні методики оздоровлення рослин від вірусів методом термотерапії передбачають інактивацію вірусної інфекції температурами 30-50^оС, які протягом певного періоду експозиції не завдають шкоди фізіології самої рослини. Наприклад, витримування насіння соняшника, пшениці і деяких видів рослин при температурах 45-50^оС протягом однієї години пригнічує вірусні інфекції і не порушує ріст зародка. Цей метод дозволяє брати для оздоровлення більші за розміром меристеми, які набагато краще виживають на поживних середовищах ін вітро (0,3-0,8 мм).

Метод термотерапії меристем має свої особливості: якщо в умовах високих природних температур (30-50^оС) вірус не ін активується повністю, то можливо одержати безвірусний матеріал з тих органів, які утворилися при цій температурі. Застосування методу особливо ефективне при отриманні безвірусних рослин, які розмножуються вегетативно (плодові, декоративні та квіткові рослини).

Спільною співпрацею вчених Росії, України і Бєларусі розроблені основні елементи технології безвірусного садивного матеріалу, яка складається з таких етапів (на прикладі картоплі):

1. Термічна обробка матеріалу (бульб або укорінених верхівок).

2. Виділення верхівкових меристем і регенерація з них рослин.

3. Індукція столоно- і бульбоутворення. Одержання мікро бульб картоплі ін вітро.

Для термотерапії відбирають вільні від зовнішніх інфекцій бульби, які ретельно миють. Бульби прогрівають у стерильному піску в спеціальних приміщеннях без освітлення, з вологістю повітря 75% і при температурі 37-38^оС протягом 6-12 тижнів. Для різних сортів режими прогрівання можуть відрізнятися. Наприклад, для стійких до підвищених температур сортів картоплі бульби прогрівають при 40^оС по 2-3 години на добу протягом 8 тижнів (решта доби – при 16-20^оС). Меристеми розміром 0,2-0,35 мм виділяють під бінокулярним мікроскопом з етіолованих паростків (схема).

Для термообробки можна використовувати також укорінені верхівки, які зрізають з рослин картоплі і занурюють у розчин гетероауксину (50 мг/л). Термообробку проводять у спеціальних камерах або кімнатах при освітленні; температура повітря 35-37^оС, ґрунту – близько 30^оС; довжина світлового періоду – 16 год. Рослини поливають водою, яку нагрівають до 30^оС. У таких умовах рослини вирощують протягом 4-6 тижнів, після того з них виділяють пазухові бруньки і проводять всі етапи мікроклонального розмноження (лекція 3). Термообробку краще проводити восени або взимку, щоб встигнути закінчити її до початку вегетації.

Одержані рослини мікро живцюють і використовують для індукції столоно- і бульбоутворення ін вітро. Процедура передбачає посадку мікроживців з невеликими листочками на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга (підвищена концентрація сахарози 4-10%). Ріст рослини відбувається протягом трьох тижнів при 9-10-годинному фотоперіоді для ранніх сортів картоплі і 6-8-годинному – для пізніх сортів. Після цього рослини на два тижні переводять на 16-годинний фотоперіод і висаджують у теплицю.

Застосування цього методу дозволяє за 3-4 місяці одержати 2-3 тис. рослин, придатних для висадки в ґрунт, тобто близько 20 тис. мікро бульб за 9-10 місяців з однієї рослини. Це має велике значення для елітного насінництва.

Після досягнення мікро бульбами розмірів 0,7-1,8 см і відмирання рослин їх витягають із пробірок, відмивають від агару дистильованою водою і зберігають в колбах в холодильнику при 2-4^оС. Перед садінням мікро бульби прогрівають на сонці близько двох тижнів при температурі 15-20^оС.

Тривалість термічного впливу можна скоротити, використовуючи обробку садивного матеріалу гамма-променями та постійним магнітним полем. При цьому вдається зменшити експозицію термообробки в камерах, що так важливо при виконанні практичної роботи.