Неспецифічні мітогени лімфоцитів

Мітоген	Походження	Мішень
Фітогемаглютинін (ФГА)	Phaseolus vulqaris - квасоля звичайна	Т-лімфоцити
Конконавалін А (Кон А)	Canavalia ensiformis	Т-лімфоцити
Мітоген лаконосу МЛ (PWM)	Phytolaca americana	В-лімфоцити за присутності Т-лімфоцитів
Ліпополісахариди (ЛПС) грам-позитивних бактерій	E. coli (кишкова паличка) S. thyphi (сальмонела тифу) N. meninqitiqis (нейсерія менінгіту)	В-лімфоцити

Найчастіше для оцінки функціонального стану Т-лімфоцитів використовують ФГА - рослинний лектин, який одержують з квасолі. У ході реакції мононуклеарні лімфоцити, виділені з периферичної крові методом градієнтного центрифугування, культивують за присутності ФГА протягом 72 годин. Результати реакції можна обрахувати двома методами: 1) морфологічним; 2) за включенням радіоактивної мітки.

Морфологічний метод: з культури клітин готують мазки та фарбують за Романовським-Гімзою. У світловому мікроскопі з імерсійною системою визначають відсоток бластів щодо загальної кількості лімфоцитів. Результат може бути виражений також у вигляді індексу стимуляції, що являє собою відношення відсотка трансформованих клітин у культурі з ФГА до відсотка трансформованих клітин у культурі без ФГА.

Облік результатів за включенням радіоактивної мітки є зручним для потужних лабораторій. Принципово відмінним є те, що за 4 - 6 годин до закінчення культивування у лунки вносять ³Н-тимідин. Рівень включення радіоактивної мітки оцінюють на сцинтиляційному електрофотометрі. Результати виражають у імпульсах за хвилину або у вигляді індексу стимуляції.

Особливим значенням вирізняються показники спонтанного та індукованого включення ³Н- тимідину. Підвищення спонтанного рівня проліферації можна трактувати як свідчення наявності ендогенного вогнища стимуляції лімфоцитів, наприклад аутоантигенів, суперантигенів або активних метаболітів.

При проведенні оцінки індукованої проліферації більш інформативним є данні,що свідчать про подавлення відповіді на мітоген. При цьому важливо мати на увазі як абсолютну кількість включень тритію, так і індекс стимуляції. Перший показник відображає максимальні можливості літогенезу лімфоцитів, другий власне відповідь на мітогенний стимул. Ці показники знижуються при різних видах імунодефіцитів, як первинних, генетично обумовленних, так і вторинних.

Цитофлюрометрична оцінка проліферації та фаз клітинного циклу, що заснована на визначенні вмісту в клітинах ДНК:

Для мітотичного ділення клітин необхідна реплікація ДНК. При вступі в клітинних цикл вміст ДНК зростає, а після мітозу повертається до вихідного рівня, що відповідає диплоїдному набору хромосом.

Ці показники можуть використовуватись для діагностики імунодефіцитів та для контроля ефективності лікування імуномодулюючими речовинами.

Оцінка проліферативної відповіді лімфоцитів на стимуляцію через TCR.

Метод базується на радіометричній оцінці проліферації Т-клітин, індукованої впливом на мембранні молекули, що фізіологічно використовуються для передачи активаціонного сигналу, - комплекс TCR- CD3 та костимулюючу молекулу CD8.

Метод дозволяє проводити коррекцію та вибирати тактику при імунодефіцитних станах.

Методи оцінки функціонування системи цитокінів:

Існує декілька методів оцінки функціонування системи цитокінів.

• Генетичний аналіз – пошук мутацій в генах цитокінів.

• Аналіз поліморфізму генів цитокінів.

• Вивчення експресії генів цитокінів.

• Вивчення інтенсивності продукції цитокінів в культурі клітин.

• Визначення концентрації цитокінів у біологічних рідинах.

• Вивчення синтезу цитокінів на рівні окремих клітин.

• Вивчення синтезу цитокінів в тканинах.

Всі перераховані методи можуть будити поділенні на три основні групи.

• Методи оцінки біологічної активності цитокінів

• Імунохімічні

• Молекулярно-біологічні

Цитокіни	Концентрація в сироватці крові	Продукція клітинами в культурі
		спонтанна	індукована
IL -1a	0-50	0-50	100-1000
IL-1b	0-50	0-50	1000-5000
ra IL	300-700	0-500	1000-5000
IL-2	0	0	2-10
IL-4	0-50	30-50	100-400
IL-6	0-50	30-50	1000-3000
IL-8	0-50	30-100	1000-5000
IL-10	0-50	30-50	1000-3000
ФНО	0-5	30-50	500-3000
ИНФ -а	0-50	30-50	100-500
ИНФ -γ	0-10	10-100	1000-5000
Г-КСФ	10-100	30-50	1000-5000
М-КСФ	1800-7000	-	-
ГМ-КСФ	10-100	-	-
ЭПО	10-50	-	-
ТПО	50	-	-

Імунограма

Імунограмою називається комплексне дослідження показників клітин периферичної крові разом з основними показниками первинного імунологічного обстеження (Лєбедєв К.Н., 1990). За своєю інформативністю таке комплексне дослідження значно перевищує клінічне значення комплекса тестів І рівня окремо.

Імунограми практично здорових осіб різних вікових груп наведені у таблиці 9.

На значення імунологічних показників у здорових осіб впливають біологічні ритми. У однієї й тієї ж людини величина імунологічного параметра коливається протягом доби, місяця, сезонів року і це потрібно враховувати при комплексному аналізі імунограми.

На характер показників імунограми впливають різноманітні навантаження:

1. Фізіологічні: вживання їжі, фізичне, психоемоційне навантаження.

2. Нефізіологічні: переохолодження, перегрівання, паління, хімічні та фізичні фактори, фактори забруднення навколишнього середовища.

3. Клініко-географічні умови регіону, де проживають обстежувані особи. В клінічних умовах при проведенні імунологічного дослідження завжди виконується лише одна умова: забор крові проводиться вранці, натще. Інші умови (якість попереднього відпочинку, та інше) не враховуються.

Слід враховувати, що звичайні методи, які використовуються у клініці для визначення показників імунограми, несуть помилку у межах 10-15% (Лебедєв К.А., Понякіна І.Д., 1990).

Оцінка ступеня імунних розладів (Земсков A.M., 1986)

Для постановки діагноза імунопатології недостатньо лише виявити імунні розлади: потрібно знати ступінь імунних розладів та їх особливості. Використовується така формула:

п

´ 100%

оказник хворого

с ередній показник осіб аналогічного віку - 1

Якщо розрахований показник має мінус (-), то у хворого наявне зниження імунологічного показника; якщо плюс (+), то наявна гіперфункція імунної системи.

Виділені три ступеня дефіцитності імунної системи. При першому ступені показник змінено на 1 - 33% від рівня норми; при другому - на 34 - 66%; при третьому - на 67% та більше. Перший ступінь ІН не потребує корекції. II ступінь свідчить про суттєві розлади імунної системи. Пацієнти з III ступенем ІН потребують інтенсивної імунокорегуючої терапії.

Додаток