7.3.1. Ферменты в клинической диагностике

Об эффективности и надежности диагностики с использованием ферментативных тестов можно судить по их чувствительности и специфичности. Чувствительность теста определяется достоверным отличием ферментативной активности в норме и при заболевании. Специфичность ферментативного анализа считается хорошей, если достоверное изменение ферментативной активности имеет место только при одном патологическом процессе.

Чаще всего в качестве диагностических и прогностических тестов применяют ферменты, циркулирующие в плазме крови. Ферменты, воздействующие на соответствующие субстраты и выполняющие специфические физиологические функции, называются функциональными ферментами. Кроме того, в кровь могут попадать внутриклеточные ферменты, что указывает на деструкцию тканей и клеток в результате какого-либо патологического процесса. Анализ таких ферментов наиболее важен для лабораторной диагностики, так как их появление в крови не только указывает на наличие патологического процесса, но и дает возможность определять орган, подверженный деструкции. Например, имеется три молекулярных формы альдолазы, локализованных в различных органах животного организма: А-форма — в мышцах, В-форма — в печени и С-форма — в ткани мозга. Появление в крови избыточного количества той или иной формы альдолазы дает возможность идентифицировать больной орган и определять степень деструкции его клеток.

Появление в крови большого количества а-амилазы или липазы свидетельствует о наличии острого панкреатита, а лактатдегидрогеназы — инфаркта миокарда. Увеличение в сыворотке крови активности кислой фосфатазы однозначно указывает на наличие рака предстательной железы, а повышенное содержание церулоплазмина связано с наследственной патологией — гепато-лентикулярной дегенерацией.

Специфичность ферментативных тестов можно значительно повысить, проводя анализ не общей ферментативной активности, а отдельных молекулярных форм или изоэнзимов. Для этого применяют такие методики, как электрофорез, ионообменную или гель-распределительную хроматографию, изоэлектри-ческое фокусирование. Еще одним методом анализа изоферментов может служить использование специфических к изоферменту антител. Этот метод обладает высокой чувствительностью и может быть легко автоматизирован. В последние годы получила распространение диагностика наследственных заболеваний при помощи рекомбинантных ДНК и метода полимеразной цепной реакции. В этой технологии большую роль играют ферменты рестриктазы.

7.3.2. Молекулярные основы энзимопатий

Ферменты имеют белковую природу, и их синтез находится под генетическим контролем. Если патологический процесс обусловлен временным дефицитом соответствующего фермента, то показана заместительная энзимотерапия. Однако нередки случаи, когда дефицит или полное отсутствие фермента связано с генетическими мутациями, вызывающими наследственные болезни.

Известны многочисленные случаи наследуемых нарушений синтеза белка, приводящих к тяжелым патологическим состояниям. Например, частичное подавление синтеза а- или (3-цепей гемоглобина приводит к развитию гемолитических анемий или талассемий. В некоторых странах широко распространена р-талассемия, связанная с наличием дефектных генов, кодирующих синтез р-цепей гемоглобина. Мутации генов, кодирующих синтез а-цепей, приводят к тяжелым последствиям уже на уровне внутриутробного развития плода.

Наследственные болезни чаще всего связаны с недостатком одного или нескольких ферментов в результате подавления их синтеза. Это приводит к нарушениям тех или иных обменных процессов и, как следствие, развитию различных заболеваний. Из-за отсутствия какого-либо фермента определенные звенья метаболических путей, состоящих из последовательно протекающих реакций, оказываются блокированными. При этом метаболиты, образованные до дефектного звена, накапливаются в патологических количествах, а метаболиты, синтез которых связан с последующими этапами, не образуются вовсе. Это вызывает развитие физиологически не обоснованных биохимических реакций, затрагивающих многие жизненно важные функции живого организма. Рассмотрим отдельные примеры.

Нарушение углеводного обмена. В результате дефицита фосфофруктоки-назы происходит снижение скорости гликолиза в мышцах и патологическое отложение гликогена. Гликолиз подавлен также в эритроцитах, что может быть причиной их хронического гемолиза.

Энзимопатия гексокиназы является причиной гемолитической анемии в результате преждевременного распада эритроцитов.

Галактоземия представляет собой врожденное нарушение углеводного обмена, связанное с дефицитом или полным отсутствием фермента, превращающего галактозу в глюкозу. В детском возрасте галактоза является весьма существенным компонентом питания, являясь составной частью лактозы — основного углевода молока. Галактоза в организме превращается в глюкозу-1-фосфат следующим образом:

Превращение галактозо-1-фосфата в глюкозо-1-фосфат происходит при помощи фермента галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы. Именно этот фермент отсутствует при врожденной галактоземии.

На основе иммобилизованных ферментов получают электроды многократного действия. Электродом, изготовленным с помощью растворимого фермента, можно провести около 50 измерений, а с помощью химически иммобилизованного на нерастворимом носителе несколько сотен измерений.

Данные о характеристиках некоторых ферментных электродов представлены в табл. 7.1.

Определение оротовой кислоты можно проводить при помощи соответствующей дегидрогеназы оротовой кислоты. Фермент при помощи НАДН катализирует восстановление оротовой кислоты и образования НАД. Кокарбоксилаза в крови определяется при помощи пирофосфотазы из Asp. niger, расщепляющей ее с образованием тиамина, по количеству которого и определяют концентрацию кофермента.