6.3.2. Влияние концентрации субстрата

Одним из наиболее важных факторов, влияющих на скорость фермента­тивных реакций, является концентрация субстрата.

В большинстве случаев график зависимости скорости ферментативной ре­акции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу (рис. 6.5).

Кривую можно разбить на два участка: участок, на котором согласно зако­ну действующих масс скорость реакции пропорциональна концентрации ре­агирующих веществ, и участок, на котором скорость реакции не зависит от концентрации субстрата, она постоянна и максимальна.

Числовое значение субстрата, при котором скорость реакции равна поло­вине максимальной скорости, называется константой Михаэлиса К_м.

Рис. 6.4. Зависимость скорости реак- Рис. 6.5. Зависимость между скоростью ции v от концентрации фермента Е реакции и концентрацией субстрата

Основные положения ферментативной кинетики, основанные на взаимо­отношениях между ферментами и различными концентрациями субстратов, были разработаны еще в 1913 г. Л. Михаэлисом и М. Ментен. Предложенные ими уравнения, связывающие скорость реакции с концентрацией субстрата, в дальнейшем незначительно видоизменялись, однако общие принципы оста­лись незыблемыми. Согласно этим принципам, фермент Е и субстрат S всту­пают в реакцию со скоростью, константа которой обозначается к₊₁. При этом образуется комплекс ES, способный диссоциировать на исходные фермент и субстрат со скоростью, константа которой обозначается k__v В случае же про­дуктивной ферментативной реакции из этого комплекса со скоростью к₊₂ вы­деляются фермент и продукты превращения субстрата. Моносубстратную ферментативную реакцию можно записать следующим образом:

где Р — продукты превращения субстрата.

В момент времени / концентрация свободного фермента будет равна [Е₀] — [ES]. Если концентрация субстрата гораздо больше, чем концентрация фермента, находящегося в составе фермент-субстратного комплекса, то содер­жанием субстрата в этом комплексе можно пренебречь. В этом случае ско­рость образования фермент-субстратного комплекса будет равна:

В состоянии равновесия скорость образования комплекса и его распада равна, следовательно:

После ряда упрощений получаем:

Наряду с образованием фермент-субстратного комплекса возможна его диссоциация со скоростью к__г на фермент и исходный субстрат, а также рас­пад с образованием продуктов реакции, протекающий со скоростью к₊₂. Этот процесс описывается уравнением

Л. Михаэлис и М. Ментен постулировали, что скорость реакции опреде­ляется как скорость распада фермент-субстратного комплекса (константа ско­рости равна к₊₂). Следовательно:

Подставляя вместо [ES] его значение, из уравнения (5) получаем:

Упростить это уравнение можно следующим образом: обозначим £₊₂[Е₀] как У_тзх, т. е. скорость реакции в условиях, когда весь фермент связан с суб­стратом, а (к₊₂ + к__х)/к+_х как константу Михаэлиса К_м. При подстановке этих величин в уравнение (7) получаем:

Уравнение (8) является основным уравнением Михаэлиса—Ментен при­менительно к моносубстратным ферментативным реакциям. Это уравнение связывает между собой начальную скорость реакции, максимальную скорость реакции и исходную концентрацию субстрата. В случае, если начальная ско­рость реакции равна половине максимальной скорости реакции, уравнение (8) принимает вид:

Разделив обе части уравнения на V_max, получаем:

Решая уравнение (10) относительно К_м, получаем, что К_м равно [S].

Следовательно, константа Михаэлиса численно равна такой концентра­ции субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна полови­не максимальной.

Константа Михаэлиса имеет большое значение при исследовании фер­ментов; она является весьма важным параметром, характеризующим, в част­ности, степень сродства фермента к субстрату.

Выражение, обратное уравнению (8), представляет собой:

Рис. 6.6. Определение К_м и F_max методом двойных обратных величин

Рис. 6.7. Определение К_м и V_mm методом Эди—Хофсти

Это линейное уравнение Лайнуивера—Бэрка, благодаря которому воз­можно определять в одном эксперименте константу Михаэлиса и максималь­ную скорость исследуемой ферментативной реакции.

В графическом варианте метод Лайнуивера и Бэрка называют еще мето­дом двойных обратных величин (рис. 6.6). При построении графика на оси абсцисс откладывают величину, равную 1/[S], а на оси ординат — l/V_max.

В некоторых случаях для определения константы Михаэлиса и максималь­ной скорости реакции более перспективным является метод Эди—Хофсти. При использовании этого метода на оси ординат откладывают v, на оси абсцисс — v/[S]. Полученная прямая линия отсекает на оси ординат отрезок, равный V_max, а с осью абсцисс образует угол а, тангенс которого равен V / К_м (рис. 6.7).