Определение активности ферментов

Термин активность достаточно условен и характеризует способность ферментов изменять скорости соответствующих реакций. Определяется активность по количеству продуктов реакции или модификации субстрата под действием фермента. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение в 1 мин при 25 °С одного микромоля субстрата. Активность ферментов выражают также в каталах (кат), связанную с превращением одного моля субстрата в 1 с при 25 °С. Удельной активностью называется скорость реакции, рассчитанная на 1 мг белка фермента.

Для корректного определения ферментативной активности условия опыта должны быть максимально стандартизованы и проводиться в условиях оптимума температуры и рН. Количество субстрата должно быть равным или большим, чем необходимо для поддержания максимальной скорости реакции. Разнообразие методов оценки ферментативной активности связано с большим количеством вариантов ферментативных реакций. Если продукты реакции или модифицированные субстраты окрашены, то с большим успехом используют спектрофотометрические методы, в случае газообразных продуктов реакции весьма эффективен полярографический метод и т. д. Определение каталитической активности весьма важно для оценки действия фермента. Кроме того, знание удельной активности того или иного фермента дает возможность определить истинное содержание его в клетках.

ПРИНЦИПЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Общая характеристика

Любая каталитическая реакция предполагает изменение скоростей как прямой, так и обратной реакции за счет снижения ее энергетики. Если химическая реакция протекает с вьделением энергии, то, казалось бы, она должна начинаться спонтанно. Однако этого не происходит, потому что компоненты реакции должны быть переведены в активированное (переходное) состояние. Энергия, необходимая для перевода реагирующих молекул в активированное состояние, называется энергией активации. Переходное состояние характеризуется непрерывным образованием и разрывом химических связей, причем между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие. Скорость прямой реакции зависит от температуры и разности значений свободной энергии для субстрата в переходном и основном состояниях. Эта разность называется свободной энергией реакции.

Достижение переходного состояния субстрата возможно двумя путями: придать реагирующим молекулам избыточную энергию (например, за счет увеличения температуры) или снизить энергию активации соответствующей химической реакции (рис. 6.1). Общие черты всех каталитических реакций заключаются в том, что они связаны со снижением энергии активации.

Ферменты «помогают» субстратам принять переходное состояние за счет энергии связывания при образовании фермент-субстратного комплекса. Снижение энергии активации при ферментативном катализе обусловлено увеличением числа стадий химического процесса. Индуцирование ряда промежуточных реакций приводит к тому, что исходный активационный барьер дробится на несколько более низких барьеров, преодолеть которые реагирующие молекулы могут гораздо быстрее, чем основной.

Механизм действия ферментов

При взаимодействии фермента с субстратом можно выделить три стадии:

• присоединение субстрата к макромолекуле фермента;

• непосредственно ферментативная реакция;

• отделение продуктов превращения субстрата от фермента.

Первая стадия — самая медленная — является лимитирующей стадией каталитического процесса в целом. Скорость ее протекания зависит от структур фермента и субстрата, природы среды, в которой осуществляется ферментативная реакция, рН и температуры. Ферменты характеризуются специфичностью по отношению к субстратам и высокой энергией связывания с ними. Эта энергия частично используется для деформации субстрата и снижения энергии активации последующей химической реакции.

Взаимодействию фермента с субстратом предшествует сближение и ориентация субстрата по отношению к активному центру фермента. Затем образуются фермент-субстратные комплексы, реальное существование которых может быть зафиксировано различными способами. Наиболее наглядным и эффективным является метод рентгеноструктурного анализа. В качестве примера можно привести идентификацию фермент-субстратного комплекса карбокси-пептидазы А и ее субстрата глицил-тирозина. Метод дает возможность не только установить сам факт образования комплекса, но и определить типы связей. Более простым, но достаточно эффективным методом является спектральный анализ фермента и соответствующего фермент-субстратного комплекса. Таким образом, были, в частности, идентифицированы фермент-субстратные комплексы для ряда флавиновых ферментов. В последние годы широкое распространение получило применение синтетических субстратов, благодаря которым можно моделировать ряд стадий ферментативного процесса, в том числе и связанных с образованием фермент-субстратного комплекса.

Взаимодействие фермента с субстратом вызывает локальное конформа-ционное изменение некоторых сайтов белковой макромолекулы фермента, в результате чего комплементарность его активного центра к субстрату резко повышается и обеспечивает возможность осуществления каталитического процесса. Изменение конформации фермента под действием субстрата было впервые показано Д. Кошландом и носит название индуцированное соответствие.

Гибкость активного центра фермента. Активные центры ферментов расположены в шарнирных сайтах между двумя доменами. Эти сайты более лабильны, чем другие участки белковой макромолекулы, поэтому активные центры обладают повышенной чувствительностью к денатурирующим агентам, физическим факторам и протеолитическим воздействиям. Гибкость структуры активного центра является фактором, увеличивающим эффективность каталитического акта. Мгновенные переходы от одного конформационного состояния к другому, обусловленные гибкостью активного центра, являются обязательным условием реализации максимальной ферментативной активности.

Фермент, в свою очередь, оказывает значительное влияние на субстрат. Под влиянием фермента структура субстрата изменяется: сначала образуется переходное состояние, а затем продукты ферментативной реакции. Оказалось, что для фермента каталитически выгодно комплементарное соответствие не основному, а переходному состоянию субстрата. Это также было доказано при помощи синтетических аналогов переходного состояния субстрата. Л. Полинг и Дж. Холдейн предложили концепцию деформации субстрата, связанную с его модификацией под действием фермента. Однако главным является то, что субстрат в переходном состоянии взаимодействует с ферментом многократно эффективнее, чем в основном, в результате происходит более резкое снижение энергии активации ферментативной реакции. Что же касается деформации, то переходное состояние сопровождается изменением геометрии субстрата, но это не обязательно связано с процессом его деформации.

Типы ферментативного катализа. В результате образования комплекса происходит обмен электронами и протонами между ферментом и субстратом. Если фермент отдает электронную пару субстрату, т. е. если фермент является донором электронов, осуществляющим нуклеофильную атаку, которая определяет скорость ферментативной реакции, то имеет место нуклеофильный катализ. Скорость каталитической реакции определяется электронодонорной способностью нуклеофила, т. е. тех аминокислотных остатков активного центра, которые взаимодействуют с субстратом. Относительные скорости нукле-офильной атаки зависят от энергии, необходимой для доставки электронной пары к атому субстрата. В электрофильном катализе, напротив, фермент акцептирует пару электронов от субстрата. Электрофильный катализ характерен для многих ферментов, имеющих в своем составе атомы металлов. Металлы с переменной валентностью являются электрофильными катализаторами, принимающими электронную пару.

В процессе общего кислотно-основного катализа происходит перенос протона либо в пределах молекулы субстрата, либо от одного субстрата к другому. Следует отметить, что многие электро- или нуклеофильные реакции протекают более эффективно, если они сопровождаются одновременным переносом протона на субстрат. Для общего кислотно-основного катализа характерна зависимость скоростей реакций от любых кислот или оснований, находящихся в реакционной среде, в отличие от специфического кислотно-основного катализа, который зависит только от протондонорных или протонакцепторных свойств катализатора.

Обобщая представления о ферментативном катализе, можно выделить следующие основные моменты.

• Комплементарное присоединение субстрата к активному центру фермента является основным фактором эффективного каталитического процесса.

• Комплементарность достигается за счет изменения конформации активного центра фермента под действием субстрата, а также перевода субстрата в переходное состояние, индуцируемого функциональными группировками активного центра фермента.

• Эффективный активный центр фермента формируется в несколько этапов. В простейшем варианте это связано с образованием третичной структуры белка-фермента, а также достижением индуцированного соответствия определенному субстрату. В случае образования ферментов в неактивном состоянии их активация (например, за счет ограниченного протеолиза) приводит к изменению конформации, что обеспечивает взаимодействие функциональных группировок активного центра. Формирование активных центров сложных ферментов обусловлено также присоединением небелкового компонента.

• Образование фермент-субстратного комплекса достигается за счет множественных контактов между ферментом и субстратом, причем чем больше этих контактов, тем эффективнее протекает каталитический процесс.

• Ферментативный катализ в основном связан с обменом электронов и протонов между ферментом и субстратом или же в пределах молекулы субстрата.

Механизм действия алкогольдегидрогеназы

Алкогольдегидрогеназа — цинксодержащий металлофермент, катализирующий окисление спиртов до альдегидов или кетонов:

В качестве кофермента алкогольдегидрогеназа, как и другие дегидро-геназы, использует НАД⁺. Молекула фермента, выделенного из печени лошади, представляет собой гомодимер с молекулярной массой 40 kDa. Каждая цепь имеет один сайт связывания НАД⁺ и два сайта связывания Zn. Внутри гидрофобного кармана в месте соединения каталитического и связывающего НАД⁺ находится ион Zn. Координационное число цинка равно четырем (рис. 6.2).

Окисление спиртов обусловлено формированием тройного продуктивного комплекса, причем первой стадией реакции является связывание кофермента НАД⁺.

При образовании фермент-субстратного комплекса происходит замещение ионизированным спиртом связанной с цинком молекулы воды (рис. 6.3).

В результате ферментативной реакции протон от субстрата переносится на кофермент и образуется ацетальдегид. В данной реакции лимитирующей стадией является диссоциация комплекса фермент — НАДН.

Основы ферментативной кинетики

Ферментативная кинетика изучает скорости реакций, катализируемые конкретными ферментами.

Иными словами, ферментативная кинетика — это наука, изучающая закономерности влияния природы реагирующих веществ и сопутствующих факторов на скорости ферментативных реакций.

Строение веществ, вовлеченных в химические реакции, определяет скорость каталитического процесса. Например, гидролиз пептидной связи под действием протеиназ происходит с различной скоростью, зависящей от строения конкретной белковой макромолекулы, вовлеченной в реакцию.

Ферментативные реакции частично подчиняются закону действующих масс, следовательно, их скорости зависят от концентрации фермента, субстрата и температуры. Скорость реакции связана с реакционной способностью функциональных группировок активного центра фермента, т. е. она зависит от рН реакционной среды. На скорость ферментативной реакции влияет также концентрация коферментов, активаторов и ингибиторов той или иной ферментативной реакции.

Изучение ферментативной кинетики имеет важное общебиологическое значение, так как оно позволяет более полно судить о механизме действия фермента. В практическом плане кинетические характеристики, в частности, могут расширить представления о механизмах действия тех или иных лекарственных веществ на ферментные системы.

Влияние концентрации фермента

При условии избытка субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента:

v = k[E],

где v — скорость реакции; [Е] — концентрация фермента; к — константа скорости реакции.

На рис. 6.4 представлено влияние концентрации фермента аргиназы на скорость расщепления аргинина. Отклонение от прямо пропорциональной зависимости возможно в случае дефицита субстрата или кофермента (применительно к соответствующим сложным ферментам), наличия в реакционной среде токсических примесей.

Влияние температуры

Температура является существенным фактором, влияющим на скорость ферментативной реакции. Для большинства ферментов, вовлеченных в одно-субстратную каталитическую реакцию, зависимость ее скорости от температуры описывается колоколообразной кривой (рис. 6.8).

На восходящем участке кривой скорость реакции, согласно закону действующих масс, пропорциональна температуре, хотя, в отличие от тривиальных химических реакций, скорость ферментативных процессов обусловлена такими факторами, как влияние температуры на стабильность ферментов, скорость распада фермент-субстратного комплекса, сродство фермента к субстрату и др. Нисходящая ветвь кривой обусловлена в основном денатурацией фермента и, как следствие, дезинтеграцией его активного центра. Исходная термолабильность фермента является одним из важных показателей протекания ферментативных реакций при различных температурах.

Влияние рН

Ферменты крайне чувствительны к изменению концентрации водородных ионов. Это обусловлено такими причинами, как степень ионизации функциональных группировок, особенно в активном центре фермента, изменениями структуры белковой макромолекулы, а также влиянием рН на степень связьшания фермента с субстратом. Так же как и температурная зависимость, рН-зависимость скорости ферментативной реакции имеет колоколообразную форму (рис. 6.9).

Функциональные группы активного центра фермента наиболее эффективно взаимодействуют с субстратом, имея оптимальную степень ионизации, обусловленную соответствующим значением рН. Это соответствует максимальной скорости реакции, отклонение от этих значений приводит к снижению скоростей реакции, а при крайних значениях рН – и к денатурации белка-фермента. Влияние рН на образование фермент-субстратного комплекса, кроме ионизации функциональных группировок фермента, может оказывать существенное влияние на определенные группы субстрата, что также влияет на скорость реакции.

Влияние концентрации субстрата

Одним из наиболее важных факторов, влияющих на скорость ферментативных реакций, является концентрация субстрата.

В большинстве случаев график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу (рис. 6.5).

Кривую можно разбить на два участка: участок, на котором согласно закону действующих масс скорость реакции пропорциональна концентрации реагирующих веществ, и участок, на котором скорость реакции не зависит от концентрации субстрата, она постоянна и максимальна.

Числовое значение субстрата, при котором скорость реакции равна половине максимальной скорости, называется константой Михаэлиса К_м.

Основные положения ферментативной кинетики, основанные на взаимоотношениях между ферментами и различными концентрациями субстратов, были разработаны еще в 1913 г. Л. Михаэлисом и М. Ментен. Предложенные ими уравнения, связывающие скорость реакции с концентрацией субстрата, в дальнейшем незначительно видоизменялись, однако общие принципы остались незыблемыми. Согласно этим принципам, фермент Е и субстрат S вступают в реакцию со скоростью, константа которой обозначается к₊₁. При этом образуется комплекс ES, способный диссоциировать на исходные фермент и субстрат со скоростью, константа которой обозначается А:_,. В случае же продуктивной ферментативной реакции из этого комплекса со скоростью к₊₂ выделяются фермент и продукты превращения субстрата. Моносубстратную ферментативную реакцию можно записать следующим образом:

Е + S -^-* ES -^* Е + Р (1)

где Р — продукты превращения субстрата.

В момент времени t концентрация свободного фермента будет равна [Е₀] — [ES]. Если концентрация субстрата гораздо больше, чем концентрация фермента, находящегося в составе фермент-субстратного комплекса, то содержанием субстрата в этом комплексе можно пренебречь. В этом случае скорость образования фермент-субстратного комплекса будет равна:

^=*₊₁[S]-([E₀]-[ES]). (2)

Наряду с образованием фермент-субстратного комплекса возможна его диссоциация со скоростью к__х на фермент и исходный субстрат, а также распад с образованием продуктов реакции, протекающий со скоростью к₊₂. Этот процесс описывается уравнением

^=*_,[ES] + *₊₂[ES]. (3)

В состоянии равновесия скорость образования комплекса и его распада равна, следовательно:

*₊₁([Е₀] - [ES]) • [S] = (*_, + к₊₂) ■ [ES]. (4)

После ряда упрощений получаем:

rpci _ [Ер] • [S] ,,.

^{1 J} [S] + (к₊₁ + *_,)/*+, • ^w)

Л. Михаэлис и М. Ментен постулировали, что скорость реакции определяется как скорость распада фермент-субстратного комплекса (константа скорости равна к₊₂). Следовательно:

u = *₊₂-[ES]. (6)

Подставляя вместо [ES] его значение, из уравнения (5) получаем:

₌ к₊₇[Е₀] ■ [S] _т

[S] + (к₊₂ + к_,)/к_+] ■

Упростить это уравнение можно следующим образом: обозначим А:₊₂[Е₀] как V_max, т. е. скорость реакции в условиях, когда весь фермент связан с субстратом, а (к₊₂ + £_,)Д₊₁ как константу Михаэлиса К_м. При подстановке этих величин в уравнение (7) получаем:

Кы + [S]

Уравнение (8) является основным уравнением Михаэлиса—Ментен применительно к моносубстратным ферментативным реакциям. Это уравнение связывает между собой начальную скорость реакции, максимальную скорость реакции и исходную концентрацию субстрата. В случае, если начальная скорость реакции равна половине максимальной скорости реакции, уравнение (8) принимает вид:

(9)

2 К_м + [S] ■

Разделив обе части уравнения на V_mm, получаем:

1= [S3 . (Ю)

2 K_w + [S] ^V ">

Решая уравнение (10) относительно К_м, получаем, что К_м равно [S].

Следовательно, константа Михаэлиса численно равна такой концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине максимальной.

Константа Михаэлиса имеет большое значение при исследовании ферментов; она является весьма важным параметром, характеризующим, в частности, степень сродства фермента к субстрату.

Выражение, обратное уравнению (8), представляет собой:

Это линейное уравнение Лайнуивера—Бэрка, благодаря которому возможно определять в одном эксперименте константу Михаэлиса и максимальную скорость исследуемой ферментативной реакции.

В графическом варианте метод Лайнуивера и Бэрка называют еще методом двойных обратных величин (рис. 6.6). При построении графика на оси абсцисс откладывают величину, равную 1/[S], а на оси ординат — \/V_nax.

В некоторых случаях для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции более перспективным является метод Эди—Хофсти. При использовании этого метода на оси ординат откладывают v, на оси абсцисс — y/[S]. Полученная прямая линия отсекает на оси ординат отрезок, равный V_max, а с осью абсцисс образует угол а, тангенс которого равен V_max / К_м (рис. 6.7).