2.2.5. Другие оптические методы

К ним относятся: а) рефрактометрия – метод, основанный на измерении показателя преломления при прохождении луча света через границу раздела прозрачных однородных сред; б) нефелометрия и турбидиметрия – методы, которые применяются для анализа суспензий, эмульсий, взвесей и других мутных сред. Нефелометрический метод определения концентрации основан на измерении интенсивности света, рассеянного взвешенными частицами, а турбидиметрический – на измерении интенсивности света, прошедшего через эту среду.

Хроматографический метод анализа и разделения сложных смесей.

Хроматографические методы анализа за последние годы нашли самое широкое распространение в решении ряда важнейших вопросов в химии, биологии, медицине и многих других областях науки и техники.

Обладая высокой чувствительностью хроматографические методы дают возможность разделять и выделять в чистом виде различные вещества из сложных смесей близкие по своей природе химические соединения. именно благодаря хроматографическому анализу появилась возможность разделения столь близких по своим свойствам таких соединений как стериоизомеры, а также разнообразные вещества, входящие в состав растений, - аминокислоты, органические кислоты, неорганические вещества многое другое. Наши знания об антибиотиках, витаминах, алкалоидах почти целиком получены методами хроматографии.

Особая ценность хроматографического анализа состоит в том, что для анализа используют очень малые количества вещества – доли миллиграмма, а иногда и доли микрограмма.

Хроматографический метод анализа был открыт русским ботаником М. С. Цветом в 1903 году. Однако метод, предложенный Цветом. не был по достоинству оценен его современниками. Лишь в 1931 году, пользуясь методом Цвета, Кюн, Винтерштейн и Ледер выделили в кристаллическом виде α и β-каротин из сырого каротина и тем самым продемонстрировали препаративные возможности метода. К этому времени возникла острая необходимость в аффективных методах разделения сложных смесей, особенно веществ разлагающихся при нагревании и здесь незаменимой оказалась хроматография.

Еще большего развития хроматография достигла после того, как в 1941 году в основу разделения смеси веществ Джон Мартин и Синджей положили различие не в адсорбционном сродстве компонентов разделяемой смеси, а их коэффициенты распределения между двумя несмешиваюмися жидкостями. данный метод был назван распределительной хроматографией.

В 1947 году советские ученые Т. Б. Чапан, Е. Н. Чапан и Ф. М. Шемякин осуществили хроматографическое разделение смеси ионов в растворе, причем это разделение было объяснено ими, как обмен ионов сорбента на ионы из раствора, т. е. ими была открыта ионообменная хроматография, получившая в настоящее время очень широкое распространение.

В 1948 году Е. Н. Гапон и Т. Б. Гапон предложили осадочную хроматографию. В этом методе разделение веществ осуществляется в результате многократной перекристаллизации разделяемой смеси.

Своего расцвета хроматография достигла после того, как Джон Мартин и А. Т. Джеймс в 1952 году предложили новый метод хроматографии – газожидкостную распределительную хроматографию. Метод основан на различии коэффициентов распределения веществ разделяемой смеси между неподвижной жидкой фазой и подвижной газообразной или парообразной.

Значительному развитию хроматографии способствовало создание теории газовой, ионообменной и осадочной хроматографии, а также разработка в последние 15 – 20 лет новых вариантов хроматографии (хроматография, вакантная, ступенчатая, капиллярная, тонкослойная и др.).

Обобщая суть хроматографических методов разделения веществ следует отметить, что во всех случаях хроматографические компоненты анализируемой смеси распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Исходя из этого, в настоящее время хроматографическим методом называют физико-химический метод разделения смесей при котором компоненты разделяемой смеси распределены между двумя фазами одной из которых является неподвижный слой с большой поверхностью контакта, а другая фаза представляет собой поток, фильтрующийся через неподвижную фазу.

В настоящее время хроматография позволяет решать следующие задачи:

- идентификация веществ и установление различия между ними;

- разделение сложной смеси на отдельные компоненты с препаративными целями;

- испытание веществ на однородность и чистоту;

- очистка веществ от примесей;

- концентрирование вещества и его выделение из разбавленных растворов;

- количественный и качественный анализ сложных смесей;

- контроль и автоматизация производственных процессов.

Из всего разнообразия видоизменений и вариантов хроматографического метода, существующих в настоящее время, можно выделить следующие виды хроматографии:

- адсорбционную;

- распределительную;

- ионообменную;

- осадочную;

- газо-жидкостную хроматографию (гжх).

Рассмотрим на наиболее простых примерах сущность и применение каждого вида хроматографии.

1. Молекулярная адсорбционная хроматография жидких веществ.

Молекулярная адсорбция основана на том, что поверхность различных адсорбентов обладает определенным количеством свободной потенциальной энергии, мерой которой является энергия единицы поверхности, называемой капиллярной постоянной. Поскольку согласно второму закону термодинамики процессы протекают в сторону уменьшения свободной энергии, поверхностная потенциальная энергия всегда стремиться к минимальным значениям за счет накопления на поверхности адсорбента веществ с меньшей капиллярной постоянной, т. е. за счет адсорбции. Следовательно, адсорбент должен обладать как можно большей поверхностью и большим значением капиллярной постоянной по сравнению с адсорбируемыми веществами. Чем меньше капиллярная постоянная адсорбируемого вещества. тем оно более способно снизить уровень потенциальной энергии адсорбента и, следовательно, лучше адсорбируется на адсорбенте.

В качестве адсорбентов обычно применяют тонко измельченные окись алюминия, карбонат кальция, крахмал, сахар и другие вещества. Адсорбентом равномерно заполняют стеклянную трубку (колонку) и через нее фильтруют раствор, содержащий несколько веществ, подлегающих разделению. поскольку разделяемые вещества обладают различной капиллярной активностью по отношению к адсорбенту, они адсорбируются в колонке в порядке убывания адсорбционной активности, т. е. в верхней части колонки накапливается наиболее капиллярно активное вещество, а в нижней – наименее капиллярно активное. При промывании колонки каким-либо растворителем адсорбированные вещества передвигаются вниз по колонке с определенной скоростью, образуя отдельные зоны, каждая из которых содержит только одну составную часть анализируемой смеси.

Рассмотрим молекулярную адсорбционную хроматографию на примере разделения алкалоидов, содержащихся настойке белладонны.

Для выполнения этой работы берут хроматографическую колонку объемом на 10 – 20 мл. Колонку заполняют силикагелем марки, например, КСМ, измельченным до 0,05 см; На силикагель наносят 1 мл. водно-спиртовой настойки белладонны и после того, как весь раствор впитается в силикагель, колонку промывают 96% этиловым спиртом.

По мере промывания колонки спиртом компоненты настойки перемещаются вниз и через несколько минут верхний слой адсорбента, при ультрафиолетовом освещении, начинает приобретать серо-коричневую окраску, ниже видна узкая серо-зеленая зона, еще ниже бледная красно-коричневая, а нижняя часть адсорбента светится бледно-голубым светом.

Раствор собирают в виде трех фракций: первую – светящуюся бледно-голубым светом, вторую – красно-коричневым и третью – серебристо-зелено-голубым. первая фракция содержит атрогин, вторая – гиосциамин и третья – скополамин.

Количественное содержание каждого из выделенных алкалоидов определяют титрованием.

Таким образом разделение веществ методом молекулярно-адсорбционной хроматографии основано на различной адсорбируемости разделяемых веществ и различной скорости передвижения отдельных зон при промывании хроматографической колонки неводным растворителем.

2. Распределительная хроматография.

Распределительная хроматография основана на различном распределении веществ между двумя несмешивающимися жидкостями. При постоянной температуре соотношение концентраций вещества, распределившегося между двумя несмешивающимися жидкостями является величиной постоянной и определяется соотношением С1/С2=К. Если К не равно единице, то возможна глубокая очистка веществ путем последовательной экстракции вещества в сменяемых объемах одного из растворителей.

Предположим, например, что имеется смесь разных количеств веществ А и В и две практически несмешивающиеся жидкости – вода и бензол. Допустим, что в этой системе отношение коэффициентов распределения веществ А и В равно 10, т. е. они распределяются в соответствии со своей растворимостью так, что в воде вещества А оказывается в 10 раз больше, чем в бензоле, а вещества В, наоборот, в 10 раз меньше.

Приготовим ряд пробирок с водой, которые в нашем эксперименте будут выполнять функцию неподвижной фазы, и причем в первую из них равный объем бензола, а затем добавим разделяемую смесь веществ.

После встряхивания пробирки и расслоения жидкостей окажется, что в воде содержится 9 частей вещества А и 1 часть вещества В., а в бензоле 1 часть А и 9 частей В. перенесем слой бензола из первой пробирки во вторую, взболтаем содержимое и дадим ему отстояться. При перенесении бензола из второй в третью пробирку после расслоения жидкости в бензольном слое останется всего 0,01 часть А и 7,3 части В и т. д. В последней пробирке ряда слой бензола будет содержать практически только вещество В, т. к. в каждой пробирке ряда содержание вещества А в бензольном слое уменьшается на один порядок.

На практике аппаратурное оформление распределительной хроматографии очень простое и она делится на колоночную и бумажную.

В колоночной хроматографии твердый носитель (пористое вещество) прочно удерживает на своей поверхности одну из жидкостей, которая служит неподвижным растворителем. Вторая жидкость, не смешивающаяся с первой, служит подвижным растворителем. Она пропускается через колонку с небольшой скоростью.

В бумажной хроматографии в качестве носителя применяется бумага, которая обладает способностью удерживать в своих порах значительное количество воды, играющей роль неподвижного растворителя (Воздушно-сухая хроматографическая бумага содержит в себе 20 – 22% воды).

Из упомянутых двух вариантов жидкостно-жидкостной распределительной хроматографии наибольшее распространение получила бумажная хроматография.

Простейшим вариантом бумажной хроматографии является получение одномерной восходящей хроматограммы.

Рассмотрим его на примере качественного анализа смеси катионов.

Для выполнения этой работы берут пробирку с пробкой и полоску хроматографической бумаги шириной 1,5 см и длиной 15 см.

Каплю исследуемого раствора, содержащего ионы железа и кобальта, наносят пипеткой на полоску бумаги на расстоянии 6 мм. от края и высушивают. В пробирку для хроматографирования вливают 0,5 мл. растворителя (80% объемных н-бутилового спирта и 20% концентрированной соляной кислоты), и в пробирку вводят полоску бумаги на которую нанесено исследуемое вещество. Полоску бумаги укрепляют так, чтобы нижний конец, на который нанесена капля исследуемого вещества, касался растворителя, а верхний конец закрепляют на пробке, которой закрывают пробирку. Когда фронт растворителя достигнет верхнего края полоски бумаги (2 – 3 часа), опыт прекращают, полоску бумаги вынимают из пробирки и высушивают в сушильном шкафу при 110⁰С. Высушенную бумагу опрыскивают из пульверизатора раствором роданида аммония и снова высушивают. В случае присутствия в исследуемом растворе ионов Fe³⁺ и Co²⁺ после опрыскивания появляются окрашенные пятна: красное соответствует иону железа, голубое – иону кобальта.

3. Ионообменная хроматография.

Ионообменная хроматография приобрела за последние десятилетия первостепенное значение как метод препаративного разделения и аналитического определения самых различных смесей неорганических и органических соединений. В основе ионообменной хроматографии лежит обратимый стехнометрический обмен ионов, содержащихся в хроматографируемом растворе на подвижные ионы веществ, называемых ионитами или ионообменниками. Разделение смеси содержащихся в растворе ионов основано на неодинаковой способности их к обмену ионами ионита.

Между обменной хроматографией и адсорбционной молекулярной имеется существенное различие. Если молекулярная адсорбционная хроматография основана на явлении адсорбции, подчиняющейся в первом приближении теории Лэнгмюра. то ионообменные процессы основаны на стехнометрическом обмене ионов раствора с ионами ионита. В соответствии с этим вымыванием адсорбционных веществ молекулярной хроматографии может производится чистыми растворителями, тогда как ионообменной в качестве вымывающего вещества необходимо применять растворы электролитов. Однако четкой грани между этими двумя методами провести нельзя, так как обычные адсорбенты часто действуют так же, так иониты, а на ионитах частично имеет место физическая адсорбция. Несмотря на это, ионообменная хроматография обладает существенными специфическими особенностями и должна рассматриваться как самостоятельный раздел хроматографического метода. В зависимости от того, какой вид ионов участвует в обмене, иониты делят на катиониты и аниониты. Существуют также амфотерные иониты, способные осуществлять одновременный обмен катионов и анионов. Так же аниониты называются амфолитами. Катиониты способны обменивать катионы, в том числе и ион водорода. Аниониты обменивают анионы, в том числе и гидроксид ион.

Поглощающую способность ионита определяют как число г-эквивалентов ионов, поглощенных 1 килограммом ионита (или мг-эквивалентов/г). В настоящее время разработаны синтетические ионообменные смолы характеризующиеся емкостью 3 – 10 г-эквивалентов/кг.

Наиболее широко иониты применяются для получения в производственных условиях деминерализованной воды, т. е. воды, не содержащей растворенных солей, включая и соли, определяющие жесткость воды.

При получении воды высокой степени чистоты методом ионообменной хроматографии воду последовательно пропускают через хроматографическую колонку заполненную катионами в н-форме и через колонку заполненную анионитами в он-форме. При контакте с катионами воды, в которой растворен, например, NaCl, обменивает катион натрия на ион водорода, что схематически можно представить следующим уравнением.

R-H+ Na⁺ +Cl^- →R-Na+H⁺+Cl^-

При последующей обработке воды анионитами в ОН-форме поглощаются анионы

R-ОH+Н⁺+Сl +Н2О.

В уравнениях R-H и R-ОH-смола, способная к обмену катионов и анионов соответственно.

Очищаемую воду собирают в кварцевую посуду и измеряют ее электропроводность. Вычисление удельной электропроводности проводят по формуле , где к – константа сосуда; RH2O - измеренное сопротивление воды.

Таким способом обычно получают воду имеющую удельное сопротивление порядка 5·10^-8 Ом^-1·см^-1 т. е. очень чистую воду. Определение качества воды по удельной электропроводности позволяет автоматизировать технологический процесс очистки воды.

4. Осадочная хроматография.

Отличие адсорбционных хроматограмм от неадсорбционных было еще отмечено М.С. Цветом, проанализировавшим образование осадков на фильтровальной бумаге. М. С. Цвет полагал, что наряду с адсорбционными хроматограммами на бумаге могут возникать осадочные хроматограммы. Например, при капилляризации во влажном воздухе спиртового хлорофиллового экстракта спирт, поднимаясь по бумаге, обогащается водой, вследствии чего растворенные в нем пигменты выпадают в нем в осадок , образуя осадочную хроматограмму. Многие из описанных в капельном анализе реакций на бумаге также могут быть отнесены к осадочным хроматограммам.

Основным фактором, определяющим разделение смеси веществ в осадочной хроматографии, является образование труднорастворимых осадков в определенном порядке. Однако последовательное выпадение осадков в зависимости от их растворимости служит основой хорошо известного в аналитической химии метода дробного осаждения, не являющегося хроматографическим методом. Поэтому основным отличительным свойством осадогчной хроматографии является не только последовательное образование в колонке осадков, обладающих различной растворимостью, но и многократность процесса их образования и растворения. Последнее обусловливается большой поверхностью образующихся в колонке осадков и обратимостью процесса. Многократность элементарных актов образования и закрепления осадка в определенном месте колонки, а также его растворения, наряду с различием в растворимости получающихся осадков, определяют направление процесса.

Таким образом, успех разделения смеси веществ методом осадочной хроматографии в первую очередь определяется различием растворимости образующихся осадков; во-вторых, закреплением осадков в месте их образования, обеспечивающим многократность процесса.

Технику выполнения осадочной хроматографии можно рассмотреть на примере качественного анализа смеси катионов меди, кобальта и никеля, который выполняется следующим образом.

Кружок фильтровальной бумаги марки «синяя лента» диаметром 70 – 100 мм пропитывают 5% раствором силиката натрия и высушивают на воздухе. В центр подготовленной таким образом и высушенной бумаги наносят одну каплю исследуемого раствора, содержащего ионы Cu²⁺, Co²⁺ и Ni²⁺. Дав впитаться этой капле, на это же место наносят 3 – 4 капли воды, причем каждая капля должна предварительно впитаться. Затем туда же наносят 2 капли раствора аммиака, после чего бумагу сушат на воздухе. Наконец, в центр высушенной бумаги наносят несколько капель раствора проявителя (рубеановодородная кислота). При этом отчетливо проявляется концентрически расположенные зоны: ближайшая к центру оливково-зеленая зона меди, в середине – желтая зона кобальта и наиболее дальняя – синяя зона никеля. По окраске зон и порядку их расположения производится качественный анализ смеси.

5. Газо-жидкостная хроматография.

В отличии от адсорбционной хроматографии, в газо-жидкостной имеет место распределение компонентов распределяемой смеси между газообразной и жидкой фазами, причем последняя является неподвижной. Жидкая фаза наносится на твердый инертный носитель, задача которого состоит в локализации жидкости в пространстве и в таком состоянии, при котором обеспечивается наилучшая массопередача. Успех газо-жидкостной хроматографии в основном определяется выбором и правильным нанесением жидкой фазы.

Отношение концентрации анализируемого вещества в жидкой неподвижной фазе к его концентрации в газовой фазе играет первостепенную роль в разделении смеси веществ. Оно называется коэффициентом распределения. Если коэффициент распределения не зависит от концентрации растворяющегося вещества, то изотерма распределения линейна и тогда хроматографические пики оказываются симметричными.

Основные закономерности имеющие место в газовой адсорбционной хроматографии, остаются справедливыми и для ГИСХ, с той лишь разницей, что в последнем случае мы должны рассматривать не процесс адсорбции и десорбции газа или пара на поверхности адсорбента, а процесс растворения или выделения газа или пара в жидкой пленке.

Значительным преимуществом ГИСХ перед газо-адсорбционной состоит в том, что, как правило, распределение компонентов между жидкой и газообразной фазами подчиняется линейной изотерме, тогда как адсорбционная происходит по нелинейной изотерме.

Так как для различных веществ, даже относящихся к одному гомологическому ряду, значения констант распределения обязательно различаются, то теория утверждает возможность разделения любых по сложности смесей на их составляющие.

Суть ГИСХ состоит в том, что проба исследуемого вещества сложного состава вместе с газом носителем (гелий) проходит через колонку, в которой исследуемые вещества разделяются и на выходе появляются порознь в определенном порядке.