Занятие № 20. «Биохимическая детоксикация»

Цель занятия: изучить пути обезвреживания токсичных соединений.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Пути образования и обезвреживания аммиака. Чем отличаются уреотелические, урикотелические и аммониетелические животные? Чем объяснить возникновение разных путей выведения аммиака из организма птиц, млекопитающих и рыб?

2. Цикл образования мочевины. Пути образования орнитина и аспарагиновой кислоты для обеспечения орнитинового цикла.

3. В каких органах происходит образование мочевины? Дальнейшие пути ее транспортировки у различных животных. На чем основано кормовое использование мочевины? Ее превращение в пищеварительном тракте.

4. Окисление пуриновых и пиримидиновых соединений. Назовите конечные продукты пуринового обмена у разных животных.

5. Биохимические механизмы образования и обезвреживания скатола и индола.

6. Пути образования и обезвреживания желчных пигментов.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Определение мочевины в биологических жидкостях.

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

1. В три пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:

Раствор	Опытная проба, мл	Калибровочная проба, мл	Контрольная проба, мл
Исследуемый образец	0,02	–	–
Реактив 1	–	0,02	–
Дистиллированная вода	–	–	0,02
Реактив 2	4	4	4

2. Пробирки закройте алюминиевой фольгой и поместите на кипящую водяную баню точно на 10 мин.

3. После этого пробирки быстро охладите проточной водой и измерьте оптическую плотность опытной пробы (D₁) и калибровочной (D₂) против контрольного раствора при 580-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете толщиной слоя 10 мм. Измерение следует провести до 15 мин после охлаждения.

4. Рассчитайте концентрацию мочевины по формуле:

где Х  концентрация мочевины в калибровочной пробе.

Сравните полученные значения с нормальными величинами. О чем свидетельствует снижение (повышение) количества мочевины в сыворотке крови у животных?

Опыт 2. Определение индикана в моче.

Количество индикана в моче является постоянной величиной у здоровых животных. Увеличение индикана моче наблюдается при воспалении мышц, обширных травмах и при избытке триптофана в рационе животных.

Определение индикана в моче базируется на гидролизе его соляной кислотой с последующим окислением хлорным железом индоксила и тимола в соединение розово-фиолетового цвета.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Стаканчик.

4. Фильтр.

5. Стеклянная воронка.

Реактивы. 1. Моча.

2. Ацетат свинца, 10%-ный раствор.

3. Хлороформ.

4. Тимол, раствор в 96^о этаноле.

5. Реактив Жолеса (0,5 г хлорида железа (III) в 100 мл концентрированной

соляной кислоты).

1. 20 мл мочи смешайте с 10 мл раствора уксуснокислого свинца. Встряхните. Фильтруйте смесь.

2. К 10 мл фильтрата добавьте 1 мл раствора тимола и 10 мл реактива Жолеса.

3. Через 15 минут в смесь внесите несколько капель хлороформа. Взболтайте и произведите оценку результатов исследования.

В норме отмечают розово-фиолетовое окрашивание хлороформа, интенсивность которого при выраженной диканурии повышается до красно-фиолетового.

Запишите Ваши результаты. Продуктом метаболизма какой аминокислоты является индикан? Напишите структурную формулу индикана.

Опыт 3. Определение концентрации мочевой кислоты в моче.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Установка для титрования.

Реактивы. 1. Моча.

2. Карбонат натрия, 20%-ный раствор.

3. Реактив Фолина.

4. Гексацианоферрат калия, 0,01 н раствор.

1. К 1,5 мл мочи и прибавьте 1 мл 20%-ного раствора карбоната натрия и 1 мл реактива Фолина. Перемешайте. Развивается синяя окраска.

2. Титруйте содержимое пробирки 0,01 н раствором К₃[Fe(CN)₆] до исчезновения синего окрашивания.

3. Рассчитайте содержание мочевой кислоты (в мг) в суточной моче по формуле:

,

где а – количество К₃[Fe(CN)₆] пошедшего на титрование, мл;

в – суточный диурез, мл;

1,5 – объем пробы, мл.

Коэффициент пересчета в единицы СИ 0,0059.

Напишите схему синтеза и формулу мочевой кислоты. Сравните полученные значения с нормальными величинами. О чем свидетельствует снижение (повышение) количества мочевой кислоты в моче у животных?

Опыт 4. Определение сорбционной способности эритроцитов.

Способность эритроцитов сорбировать на своей поверхности метиленовый синий зависит от функционального состояния клеточной мембраны эритроцитов и отображает ее свойство адсорбировать токсичные молекулы.

1. В центрифужную пробирку, содержащую 1 мл раствора цитрата натрия, поместите 4 мл кро­ви.

2. Центрифугируйте 10 минут при 3000 об/мин.

3. Плазму удалите.

4. 1 мл эритроцитарной массы поместите в центрифужную пробирку с 3 мл раствора метиленового синего.

5. Переме­шайте содержимое пробирки и оставmntт на 10-12 мин при комнатной температуре.

6. Затем снова центрифугируйте 10 мин. при 3000 об/мин.

7. Надосадочную жидкость налейте в кювету шириной 10 мм и определите оптическую плотность при 630 нм против воды.

Расчет ведите по формуле

где A₁ - оптическая плотность после инкубации с эритроцитами;

А₂ - оптическая плотность исходного раствора метиленового синего против воды;

X - сорбционная способность эритроцитов, в %.

В норме эритроциты способны поглощать до 37,12 % красителя. Например, при гнойно-септических состояниях показатель увеличивается до 69,9 %.

Сделайте вывод по полученным результатам.

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 22. «Контроль практических навыков биохимического анализа»

Цель занятия: закрепить приобретенные практические навыки качественного и количественного биохимического анализа.

Определите в предложенном вам биологическом образце содержание:

1. Глюкозы (см. занятие № 7),

2. Общего белка (см. занятие № 13),

3. Мочевины (см. занятие № 15),

4. Активность трансаминаз (см. занятие № 14),

5. Холестерина (см, занятие № 11),

6. -липопротеидов (см. занятие № 9),

Запишите полученные результаты в таблицу:

Исследуемый показатель	Полученное значение	Физиологическая норма	Вывод
Глюкоза
Общий белок
Мочевина
Активность трансаминаз
Холестерин
-липопротеиды

Сделайте вывод о клиническом состоянии животного на основании полученных результатов. Укажите предполагаемые причины, оказавшие влияние на исследуемые показатели.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Приложение 1