Модель ферментативного гидролиза

Ферментативный гидролиз происходит по следующему модельному сценарию.

1. Под действием электрического поля, создаваемого полярными группами субглобул, полипептидная цепочка субстрата втягивается в область активного центра (на рис. 4–14, кружком показана атакуемая пептидная связь). Неизменяемая часть субстрата комплементарно связывается с узнающими ее центрами фермента и ориентируется оптимальным образом относительно атакующих пептидную связь групп активного центра. В этом положении белок субстрата фиксируется (рис. 4–15 а).

2. Под действием субстрата изменяется профиль потенциального рельефа вдоль водородной связи N – – – HO, изображенной на рис. 4–14: в центральной части потенциального барьера появляется дополнительный минимум; глубина левой потенциальной ямы увеличивается; потенциальный барьер, разделяющий левый и правый минимумы уменьшается.

3. Перестройка потенциального рельефа резко увеличивает вероятность переноса протона из правого минимума в левый. В переносе протона от Ser195 участвуют His57, принимающий Н⁺, и играющий вспомогательную роль Asp102 , в результате чего атом кислорода в субглобуле А, приобретая заряд –е, активируется О^– (рис. 4–15 а), а His57 приобретает заряд +е.

4. Активированный атом О^– атакует С-атом расщепляемой пептидной группы, завязывая с ним временную ковалентную связь, переводя тем самым связи С-атома в тетраэдрическую форму, соответствующую sp³-гибридизации. Образуется активированный комплекс. Отрицательный заряд атома кислорода перетекает на пептидную связь, которая так же как при обычном катализе в водной среде, становится одинарной. Активированный комплекс – это переходное состояние. При образовании четвертой связи С–О^– с активированным атомом О^–, отрицательный заряд, перетекая на пептидную связь, втягивается в оксианионовую дыру, где имеются два протона (рис. 4–15 а). Электростатическая и водородная связь О^– с положительно заряженными протонами оксианионовой дыры понижают энергию переходного состояния тетраэдрического комплекса. Переходное состояние – это самое нестабильное состояние в ходе всего процесса. Снижение энергии переходного состояния (энергетического барьера) приводит к увеличению скорости реакции. Полипептидная связь N–С разрывается (рис. 4–15 б).

При разрыве связи N–C к атому N присоединяется протон Н⁺ от His57, заполняя свободную орбиталь у N и образуя правую концевую группу –NН₂, отрезанного верхнего участка цепи (рис. 4–15 б). Свободную орбиталь у атома азота нейтрального остатка His57 (б) заполняет ион Н⁺ из раствора (в), что приводит к образованию неустойчивого положительного иона His57⁺ (г). Затем ион H⁺ His57⁺ переходит в правую (ближнюю к О Ser195) потенциальную яму, в результате чего His57 становится нейтральным, как в исходном состоянии (рис. 4–14). Гидроксильная группа ОН– из раствора присоединяется к атому С (в, г) у нижней части разрезанной полипептидной цепи с образованием тетраэдрического переходного состояния (г).

5. При разрыве полипептидной связи нарушается комплементарность ее неизменяемого участка и ориентирующего участка на субглобуле А, в результате чего разорванные части цепи освобождаются и выходят из области активного центра фермента.

Таким образом, ферментативная реакция идет в две стадии: сначала образуется комплекс N-концевого пептида с О атомом серина и отщепляется С-концевой пептид. На второй стадии N-концевой пептид заменяет связь с О атомом серина на связь с О атомом воды. Без фермента реакция идет в одну стадию, в которой сразу образуется комплекс N-концевого пептида с О атомом воды, а С-концевой пептид отщепляется. Обе реакции идут через тетраэдрический активированный комплекс, причем рядом с комплексом находится донор протона (His⁺57 в ферменте, в воде Н⁺ или ).

Скорость ферментативной реакции примерно в ~10¹⁰ раз выше, чем обычной, не ферментативной. Увеличение скорости реакции является след-ствием снижения энергетического барьера (рис. 4–16). Снижение энергетического барьера связано с понижением свободной энергии переходного (самого нестабильного по ходу реакции) состояния на . Это понижение достигается, во-первых, за счет сбора на ферменте всех необходимых компонентов реакции, то есть увеличения энтропии системы. Во-вторых, энергия понижается за счет образования химических связей фермент – субстрат (с протонами оксианионовой дыры) в переходном состоянии.

Рис. 4–16. Схема преодоления энергетического барьера при не ферментативном гидролизе пептидной цепи (пунктирные стрелки) и при ферментативном гидролизе (сплошные стрелки), когда свободная энергия переходного состояния снижается на за счет образования ковалентных связей субстрата/продукта с каталитическим центром фермента. Свободные энергии начального и конечного состояния субстрата и продукта положены одинаковыми

Существуют протеазы, не похожие на сериновые, например, металлопротеазы. У них ключевую роль в катализе играет ион цинка Zn⁺⁺, удерживаемый в белке (металлопротеазе) координационными связями. Благодаря сильному электрическому полю ион Zn⁺⁺ активирует молекулу воды: , находящуюся рядом с атакуемой пептидной связью. Далее разрыв пептидной связи происходит как в обычной, не ферментативной реакции. Кроме того, Zn⁺⁺ стабилизирует отрицательный заряд в тетраэдрическом переходном состоянии, аналогично действию оксианионовой дыры в сериновых протеазах.

Таким образом, ферментативные реакции характеризуются чрезвычайно высокой эффективностью и чрезвычайно высокой специфичностью по типу реакции. Это означает, что каждый фермент катализирует только ту реакцию, для которой он предназначен. Кроме того, ферменты обладают чрезвычайно высокой специфичностью по отношению к выбору соединений, реакции которых он катализирует, то есть очень высокой субстратной специфичностью.