3.5.5. Третичная структура

Третичная структура глобулярных белков обычно исследуются методом дифракции рентгеновских лучей на хорошо сформированных белковых кристаллах. По дифракционной картине рассчитывается распределение электронной плотности в кристалле (см. т.1, с. 224–230), по которой в дальнейшем восстанавливается пространственная структура молекул белка с атомным разрешением.

Домены в третичной структуре глобулярных белков

В крупных глобулярных белках часто можно выделить четко различимые области повышенной плотности – компактно свернутые фрагменты полипептидной цепи, которые принято называть доменами. Домены связаны между собой ковалентно и являются одной из особенностей третичной глобулярной структуры.

Малые белки состоят из одного домена. Различные способы изображения строения небольшого белка – α-субъединицы интерлейкина 8, состоящего из одного домена, представлены на рис.3–53.

(а)		(б)
	Рис. 3–53. Строение небольшого белка – α-субъединицы интерлейкина 8 – при разной степени схематизации. (а) – атомная модель с изображением только тяжелых атомов (атомы водорода отсутствуют). (б) – скелетная модель главной цепи (темная линия) и боковых групп (более светлые отростки). (в) – топология домена, образованного главной цепью белка, и состоящего из вторичных структур: двух α-спиралей и одного β-листа, включающего три β-тяжа. (г) – упрощенное представление домена (мотив укладки), в котором отсутствует точная ориентация α-спиралей (параллельные цилиндры) и β-тяжей (широкие стрелки).
(в)
(г)

Большинство доменов может быть представлено в виде двух- или трехслойных (реже четырехслойных) структур. Например, на схеме фосфоглицераткиназы (рис. 3–60) отчетливо видны две области повышенной плотности – два домена. Такие слои (плоские, скрученные, цилиндрические, даже квазисферические) обеспечивают стабильность структуры белка. Водорастворимым белкам иметь домены более чем с четырьмя слоями, энергетически не выгодно, так как при этом много полярных остатков с ненасыщенными водородными связями оказались бы внутри глобулы. Поэтому большие белки должны разбиваться на субглобулы и домены. Многодоменная структура особенно характерна для многоклеточных, высших по сравнению с одноклеточными эукариотами и бактериями, организмов.

Доменная структура белков способствует их эволюции (о микроскопических структурных изменениях в третичной структуре белков говорилось выше.). Известно, что гены доменов, как целое, могут «кочевать» из белка в белок, объединяясь или разъединяясь с другими. Таким перетасовкам генов, по-видимому, способствует их интрон-экзонная структура (см. ниже).

Основные типы третичных структур

Первым ферментом, для которого методом рентгеноструктурного анализа была установлена третичная структура и выявлена связь между пространственным строением фермента и механизмом его действия, был яичный лизоцим (см. рис. 3–45 и 3–54). Фермент катализирует гидролиз гликозидных связей между остатками аминосахаров, разрушая оболочки бактериальных клеток. В организме выполняет функцию антибактериального барьера.

Рис. 3–54. Ленточная модель яичного лизоцима (молекулярная масса ~14 000 ат.ед). Полипептидная связь состоит из 129 аминокислот (рис.3–45)

Третичная структура белка определяется укладкой α- и β-структур в глобулу. Каркас из α- и β-структур как бы окружает гидрофобное ядро белка, отделяя его от воды. Нерегулярные (без внутренних водородных связей) петли лежат на периферии, скользят по поверхности ядер, соединяя антипараллельные (а не параллельные) участки вторичной структуры. Причем очень редко петли перекрывают друг друга, проходят одна петля над другой или одна петля обходит вокруг другой. Это связано с тем, что при пересечении петель внутренняя петля лишается водородных связей с водой. При обходе петля сильнее изгибается, а чем сильнее согнута цепь, тем меньше у нее может быть конформаций, значит тем меньше энтропия системы и больше свободная энергия.

Число укладок ограничено по физическим причинам. Поэтому одинаковые мотивы укладки вторичных структур встречаются у белков, не связанных ни эволюционно, ни функционально. Удивительно, что одни и те же мотивы укладок цепи встречаются как у эукариотов, так и у прокариотов. Число стандартных стабильных мотивов укладки цепи относительно невелико (порядка сотен) по сравнению с числом белков, которых насчитывается многие десятки тысяч.

В то же время следует заметить, что могут происходить микроскопические изменения в структуре белка при изменении его функциональной активности. Например, гемоглобин ламы (высокогорного животного) сильнее связывает кислород, чем гемоглобины его родственников, живущих на равнине. Гемоглобин так же структурно подстраивается под условия существования. Так гемоглобин плода, забирая кислород у матери, должен связывать кислород сильнее, чем гемоглобин матери.

По третичной структуре глобулярные белки можно разделить на несколько групп. Первую группу составляют α-белки.

α-белки

Проще всего устроены α-белки, имеющие длинные α-спирали, которые укладываются в пучки. (рис.3-55).

		Рис. 3–55. Четырехспиральные пучки α-белков цитохрома (а) и гэмэритрина (б). В цитохроме показана скелетная модель гема с ионом железа (шарик), в гэмэритрине шариками обозначены ион железа и связанная с ним молекула кислорода
(а)	(б)

В глобуле миоглобина (рис. 3–56) спирали организованы в два перпендикулярных слоя, по три α-спирали в каждом. Миоглобин является кислород-связывающим белком мышц (высвобождает кислород в мышцах для поддержания метаболизма).

(а)	(б)
Рис. 3–56. Конформация миоглобина. Между имидазолом гистидина F8 (черно-белый кружок) и имидазолом аминокислотного остатка Е7 (бело-черный кружок) изображена простетическая группа, содержащая железо (группа гема)

Молекула миоглобина состоит из одной белковой субъединицы (полипептидной цепи), содержащей 153 аминокислотных остатка, последовательность которых в полипептидной цепи была установлена в 60-х годах прошлого века. На рис. 3–56 схематично изображен контур молекулы. Форма молекулы миоглобина близка к сферической (глобулярной), приблизительные размеры которой 4,5  3,5  2,5 нм. Примерно 75% аминокислотных остатков уложены в виде правых спиралей, содержащих от 7 до 20 остатков. Всего насчитывается восемь спиральных участков, обозначенных на рисунке буквами A, B, C, D, E, F, G, H. Цифра около буквы указывает номер аминокислотного остатка в данной спирали. Например, F8 – это гистидин, восьмой остаток в спирали F. Затемненными на рисунке изображены имидозольные кольца. Имидозол гистидина F8 соединен с атомом железа гема, а имидозол Е7 расположен напротив атома железа с другой стороны гемовой плоскости. Сам гем расположен в щели между спиралями E и F.

Обратим внимание на то, что при одинаковом мотиве укладки (например, в цитохроме и гэмэритрине, рис. 3–55 а,б) могут образовываться белки, выполняющие разные функции. В то же время одну и ту же функцию – связывание кислорода – могут выполнять разные по архитектуре белки (сравните гэмэритрин (рис. 3–55 б) и миоглобин (рис. 3–56)).

В белках преобладают α-спирали, так как в них атомы упакованы оптимально: плотно и без напряжений, а левых спиралей практически нет. Ядро белка (гидрофобное в водорастворимых глобулярных белках и гидрофильное – в мембранных) находится между α-спиралями и имеет вытянутую форму (для пучков) или плоскую в случае скрещенных слоев.

В глобулярных белках, состоящих из коротких α-спиралей (длиной около 20Å), наблюдается квазисферическая укладка спиралей вокруг квазишарового гидрофобного ядра (рис. 3–57).

(а)	(б)
Рис. 3–57. Пример квазисферической упаковки коротких α-спиралей в глобулярном белке (а) и модель укладки спиралей по ребрам многогранника, в центре которого расположено ядро белковой молекулы (б). Стрелками указан ход петель, соединяющих α-спирали.

В фибриллярных белках α-спирали достигают гигантской длины, включая сотни аминокислотных остатков.

β-белки

Вторая группа – β-белки. Их глобулы образуются из двух или более складчатых β-слоев. В каждом слое β-тяжи (отдельные полипептидные цепи, образующие складчатый слой) могут иметь различное относительное расположение: параллельное β↑↑ (рис. 3–58 а), антипараллельные β↑↓ (рис. 3–58 б)и смешанное, состоящее из β↑↑ и β↑↓. В белках преобладает антипараллельная β-структура. Внутри каждого β-тяжа, в отличие от α-спирали, нет водородных связей. Водородные связи соединяют отдельные β-тяжи. Так как образуемая поверхность β-листов рифленая, то ее называют β-складчатой.

Примером таких белков является конканавалин А. Конканавалин А относится к группе лектинов (от лат. leg – выбираю) – белкам, обладающим свойством специфично и обратимо связывать углеводы и их остатки в биополимерах. Конканавалин А применяется, в частности, для диагностики групп крови. Конканавалин А обладает способностью взаимодействовать с поверхностью клеток, в частности раковых, вызывая их агглютинацию (склеивание), что приводит к гибели клеток. Его молекула состоит из четырех субъединиц, каждая из которых содержит 237 кислотных остатков.

На рис. 3–59 представлена схема трансмембранного белка порина, служащего проводником полярных молекул. Порин имеет вид широкого (диаметром ~15Å) замкнутого цилиндра, сложенного из 16 длинных β-тяжей.

Рис. 3–58. Схема расположения водородных связей в параллельно (а) и антипараллельной (б) β-структурах

(а) (б)

Рис. 3–59. Вид порина – трансмембранного белка вдоль (а) и поперек (б) плоскости мембраны

α/β-белки

Рис. 3–60. Схема третичной структуры фосфоглицераткиназы

Третью группу составляют α/β-белки, полипептидная цепь которых состоит из чередующихся α-спиралей и вытянутых β-участков, сгруппированных в один β-слой. Примером таких белков является фосфоглицераткиназа (фермент, в реакциях гликолиза (с. 545-548) катализирующий перенос остатка фосфорной кислоты от 1,3-дифосфоглицериновой кислоты к аденозиндифосфату (АДФ) с образованием аденозинтрифосфата (АТФ) и 3-фосфоглицериновой кислоты). Молекула фосфоглицераткиназы состоит из 355 остатков и представляет собой два β-слоя с многочисленными -спиралями снизу и сверху слоев. (рис. 3–60). Плоские стрелки обозначают участки β-структур (β-тяжи).

(α+β)-белки

К четвертой группе относятся (α+β)-белки. Их полипептидные цепи состоят из отдельных, отделенных друг от друга участков, целиком состоящих или из α-спиралей или из β-складчатых слоев.

(а) (б)

Рис. 3–61. Структура мембранного белка бактериородопсина в структуре мембраны: (а) – в поперечном срезе и (б) – вид сверху. Цилиндры – семь α-спиралей белка, широкие стрелки – β-тяжи, образующие β-шпильку, которая располагается вне мембраны, совокупность темных шариков – модель молекулы ретиналя

На рис. 3–61 изображена структура мембранного белка (бактериородопсина), который проводит протон через мембрану. Семь α-спиралей образуют слегка наклоненный к плоскости мембраны пучок. Гидрофобные группы α-спиралей обращены к гидрофобным липидам мембраны, а полярные – внутрь узкого канала, по которому идет протон. Внутри пучка спиралей расположен кофактор (см. с. 500) – молекула ретиналя, перекрывающий центральный канал бактериородопсина. Поглотив фотон, ретиналь переходит из trans- в cis-форму (см. т.1, с.189, т.2, с. 588-594). При этом он изгибается и переносит протон с одного конца спирального пучка на другой. Отдает протон и, снова изгибаясь, возвращается в исходное состояние.

(а)	(б)
Рис. 3–62. Характерные мотивы строения α+β белков. (а) — «αβ складка» в рибосомном белке S6, в котором наблюдается чередование βαββαβ, называемое ферредексиновой укладкой. (б) — Укладка βββαββαα в нуклеазе стафилококка. Схема строения укладки в β-домене, называемая ОБ-укладкой (Oligonucleotide Binding fold), помещена отдельно (вид сверху на ортогональную упаковку β-участков). Первый β-тяж согнут, как бы сломан на две половинки 1 и 1΄

Другие характерные мотивы строения α+β белков приведены на рис. 3–62.