3.4.2. Зарядовое состояние аминокислот

Все аминокислоты в основном (изолированном) состоянии электрически нейтральны: суммарный заряд электронов и ядер у каждой аминокислоты равен нулю. Однако, поскольку ковалентные связи практически всегда имеют дипольные моменты, то аминокислоты обладают дипольными моментами, равными векторной сумме дипольных моментов всех ковалентных связей.

Когда аминокислоты находятся в водных растворах, то появляется возможность как потери, так и приобретения аминокислотами ионов водорода Н⁺. Процесс переноса протона – это кислотно-основная реакция.

Рассмотрим, например, образование отрицательно заряженной группы А^– при диссоциации кислоты АН: (уравнение диссоциации кислоты ), в которой принимают участие как кислота , так и сопряженное с ней основание (ч.3, с. 262).

Записывая отношение концентраций в уравнении Гендерсона–Хассельбалха ((5.61), с. 265) через вероятность диссоциации ((5.63), с. 265), где – полная исходная концентрация кислоты, равная , получаем

. (3.1)

С учетом (3.1) уравнение Гендерсона-Хассельбалха запишется в виде

или

(3.2)

Соотношение (3.2) определяет вероятность ионизации отрицательно заряжающихся групп при заданном рН.

Если , то ;

если , то ;

если , то .

Для положительно заряжающихся групп вероятность ионизации имеет вид, аналогичный (3.2):

(3.3)

По способности к протонированию боковые группы аминокислот разделяются на три категории:

– группы – доноры протонов, которые могут при ионизации приобретать отрицательный заряд, например,

; (3.4)

– группы – акцепторы протонов, которые могут приобретать положительный заряд, например

; (3.5)

– гидрофобные группы, состояние которых в водных растворах не изменяется.

Донорами иона водорода могут выступать карбоксильные группы СООН, а также группы ОН и SН.

Акцепторами иона водорода могут стать группы NH и NH₂, а также атом азота N в имидозольном кольце.

К гидрофобным группам относятся группы СН, СН₂, СН₃.

Процесс протонирования определяется структурой и энергией валентных связей у боковых групп. Так аминогруппы NH, NH₂, NH₃ в аминокислотах могут нести положительный заряд или быть нейтральными в зависимости от того, участвует p_z-орбиталь азота N (2s²2p³) с неподелённой парой электронов в образовании химической связи или нет.

У атомов азота в возбужденном состоянии 2s¹2р⁴ происходит sр²–гибридизация с образованием трех гибридных орбиталей, расположенных в плоскости XY под углом 120⁰ друг к другу (т.1, с.114). Возможны два варианта гибридизации.

В первом варианте гибридизируются 2(s)2(р_x)2(p_y)–орбитали, содержащие по одному электрону, а 2р_z-орбиталь, ориентированная перпендикулярно плоскости XY, несет неподелённую пару электронов (рис.3-28 а,г).

Во втором варианте гибридизируются 2(s)2(р_x)2(p_y)–орбитали. В результате из трех орбиталей, также расположенных в плоскости XY, две заполнены наполовину, а одна несёт неподеленную пару (рис.3-28 б, в). При этом 2(p_z)-орбиталь остается с одним электроном.

Аминогруппы входят в аминокислоты в конфигурациях, представленных на рис. 3–28.

Атом углерода С в белках всегда предоставляет для связи sр²– гибридные орбитали, расположенные в плоскости XY и одну р_z–орбиталь. Все орбитали заполнены наполовину.

В конфигурации, изображенной на рис. 3–28а, осуществляется первый вариант гибридизации в атоме азота. При этом между N и C образуется одинарная -связь. К двум другим связям присоединяется по одному атому Н, а к неподеленной р_z-паре электронов, не участвующей в создании связей, может присоединиться ион Н⁺. В результате образуется группа NH₃⁺, заряженная положительно.

Конфигурация, изображенная на рис. 3–28б, реализуется при образовании двойной N=С связи, когда осуществляется второй вариант гибридизации. Наполовину заполненная 2р_z– и одна из гибридных орбиталей в плоскости XY атома N образуют двойную – и –связь азота с углеродом. Вторая гибридная орбиталь азота связывается с атомом Н, а к третьей (с неподеленной парой) может присоединиться ион Н⁺. Образуется заряженная NH₂⁺ группа.

Рис. 3–28. Химические связи и возможность присоединения протона к атому азота в аминокислотах. Орбиталь с неподеленной парой электронов, расположенная в плоскости XY, обозначена двумя точками в овале, а – в плоскости, перпендикулярной плоскости XY, – двумя точками в кружке

В конфигурации (рис. 3–28в) неподеленная пара атома N⁽¹⁾, расположенная в плоскости XY может образовать связь с Н⁺. В то же время у атома N⁽²⁾ гибридизация происходит по первому варианту, и связи с соседними атомами С одинарные. Атом N⁽²⁾, используя три эквивалентных орбитали в плоскости XY, образует -связи с двумя атомами С и одним атомом Н. Орбиталь 2р_z с неподеленной парой перекрывается с -орбиталью, связывающей атомы С=N⁽¹⁾. Возникает р-сопряжение (т.1, с.137) с образованием трех трёхцентровых -орбиталей, на которых расположены четыре электрона: по одному от N и от С и два от атома N⁽²⁾. В этом случае р–орбиталь атома N⁽²⁾ участвует в образовании -связи и не может присоединять ионы Н⁺. В результате группа N⁽²⁾Н₂ остается нейтральной.

Рис. 3–29

В конфигурации рис. 3–28г у атома N⁽¹⁾ двойная (- и -) связь N⁽¹⁾=С образуется также, как в предыдущем случае. В плоскости XY остается неподеленная пара, к которой может присоединиться ион Н⁺, образуя заряженную группу NH⁺. У атома N⁽²⁾ ситуация аналогична случаю (в): благодаря πр-сопряжению и образованию трехцентровых орбиталей, связи становятся полуторными, и группа N⁽²⁾H остается нейтральной.

Аналогичная ситуация имеет место в конфигурации, изображенной на рис. 3–29. Вследствие р-сопряжения группа NH₂ не может присоединить протон.

В растворах существует определенная вероятность ионизации каждой группы. На значение вероятности (3.2), (3.3) могут оказывать влияние следующие параметры.

– Температура. Чем выше температура, тем больше кинетическая энергия колебательного движения атома водорода в связанном состоянии, тем больше вероятность отрыва Н⁺. В то же время вероятность связывания Н⁺ с образованием, например, (3.5), уменьшается.

– Энергия связи. Очевидно, что при увеличении энергии связи вероятность отщепления иона Н⁺ уменьшается, а вероятность образования положительно заряженной группы возрастает. Заметим, что энергия ионизации одной и той же боковой группы, но у разных аминокислот может изменяться, благодаря различной структуре аминокислот, различному атомному окружению ионизирующейся группы, в частности из-за отличий электроотрицательностей атомов. Кроме того, следует учитывать, что у одной и той же аминокислоты ионизация одной группы приводит к изменению распределения электронной плотности и структуры полярных гидратных оболочек, и таким образом влияет на вероятность ионизации других групп данной аминокислоты. Например, Протонирование группы может облегчить отщепление иона Н⁺ другими группами, благодаря электростатическому отталкиванию обоих ионов.

– Величина рН раствора. Так как кислотно-основные реакции (диссоциации протонирования) обратимы, то вероятность диссоциации (3.2, 3.3) (доля диссоциированных молекул) зависит от концентрации ионов Н⁺ в растворе, то есть от величины рН {п.5.9.10, с.262, рис.5-30, 5-31, с.266-267}. Увеличение рН (уменьшение концентрации ионов Н⁺ в растворе) увеличивает вероятность отщепления иона Н⁺ и образования отрицательно заряженной группы (например, СОО^–). Наоборот, уменьшение рН (увеличение концентрации ионов Н⁺) уменьшает вероятность отщепления ионов Н⁺. Для положительно заряжающихся групп ситуация противоположная: уменьшение рН увеличивает вероятность образования положительно заряженных групп, а уменьшение рН – снижает.

В

Рис. 3–30. Значения рН в организме человека. В крови величина рН изменяется в пределах 7,35–7,45; в цитоплазме несколько меньше, чем в крови 7,0–7,3; в лизосомах рН составляет 4,5–5,5, то есть концентрация Н⁺ более чем в 100 раз больше, чем в цитоплазме. Экстремальные значения рН наблюдаются в пищеварительном тракте: около 2 в желудке и более 8 в тонком кишечнике. Поскольку почки могут выделять как кислоты, так и основания, то рН в них варьируется в широких пределах

организме человека значения рН меняются в широких пределах (рис. 3–30).

Источниками протонов служат свободные кислоты пищи и серосодержащие аминокислоты белков. Кислоты, полученные с пищей (лимонная, аскорбиновая, фосфорная) отдают протоны при щелочном рН в кишечном тракте. Из аминокислот, образующихся при расщеплении белков, наибольший вклад в кислотно-основной баланс вносят метионин и цистеин. В печени атомы серы этих аминокислот окисляются до серной кислоты, которая диссоциирует на сульфат-ион и протоны.

Активное удаление протонов происходит через почки. В почках протоны переносятся из крови в мочу. Для сохранения электронейтральности в кровь поступают ионы . В моче бо́льшая часть протонов нейтрализуется буферной системой (см. с. 267–269). Часть протонов выводится с мочой, образуя соединение с аммиаком

.

Если рН крови уменьшается (сдвигается в кислую область (ацидоз), например, при диабете), то выделение ионов аммония усиливается. При сдвиге рН в щелочную область (алкалоз) выделение аммиака подавляется.

Потенциалы переноса протона рК⁺ и рК^– вблизи нейтральных рН для различных заряжающихся групп в аминокислотах представлены в табл. III–3.

Таблица III–3. Значения рК для ионизуемых групп в аминокислотах

Аминокислота		место	рК+			рК–
			N	NH	NH2	COOH	OH	SH
Кислые	Аспарагиновая кислота	Осн. часть			10,0	2,0
		R-группа				3,9
	Глутаминовая кислота	Осн.			9,7	2,2
		R				4,3
Основные	Гистидин	Осн.			9,2	1,8
		R	6,0
	Лизин	Осн.			9,0	2,2
		R			10,8
	Аргинин	Осн.			9,0	1,8
		R		12,5
Нейтральные	Серин	Осн.			9,2	2,2
		R					13,5
	Треонин	Осн.			10,4	2,6
		R					13,5
	Аспарагин	Осн.			8,8	2,0
		R
	Глутамин	Осн.			9,1	2,2
		R
Глицин		Осн.			9,8	2,4
		R
Цистеин		Осн.			10,5	1,8
		R						8,2
Тирозин		Осн.			9,1	2,2
		R					10,9
Гидрофобные кислоты	Аланин	Осн.			9,9	2,3
	Валин	Осн.			9,6	2,3
	Лейцин	Осн.			9,6	2,4
	Изолейцин	Осн.			9,7	2,4
	Метионин	Осн.			9,2	2,3
	Фенилаланин	Осн.			9,1	1,8
	Триптофан	Осн.			9,4	2,6
	Пролин	Осн.			10,6	2,0

Вероятностный характер ионизации различных групп позволяет ввести вероятностный (эффективный) заряд q* этих групп:

для отрицательно заряжающихся групп,

для положительно заряжающихся групп

и суммарный эффективный заряд аминокислоты q_Σ, который может достигать значений 2е для аминокислот, содержащих две ионогенные группы. На рис. 3–31 приведена зависимость суммарного заряда от рН среды двух аминокислот – гистидина и глицина. Суммарный заряд пептидов и белков зависит, главным образом, от ионогенных групп боковых цепей, так как группы СООН (рК=1,8) и NН₂ (рК=92), находящиеся в основной части пептида, принимают участие в образовании пептидных связей.

Как видно из рис. 3–31а, отрицательно заряжающаяся группа СООН при значениях рН меньше (рК_СООН – 1)=0,8 остается практически незаряженной, а при рН больше (рК_СООН + 1)=2,8 имеет заряд –е. Положительно заряжающиеся группы (NH₂ и имидазольное кольцо) имеют заряд +е при рН < (рК – 1) и не заряжены при рН > (рК + 1). При рН=7,6 суммарный заряд гистидина равен нулю. Аналогичная зависимость имеет место для глицина (рис.3–31 б).

Значение рН, при котором аминокислота имеет суммарный заряд, равный нулю, называется изоэлектрической точкой. Таким образом, изоэлектрическая точка гистидина рI=7,6, глицина pI=5,97.

В результате процессов протонирования аминокислоты в водных растворах могут находиться в состоянии цвиттер-ионов – молекул, содержащих одновременно положительно и отрицательно заряженные ионные центры, то есть обладающих одновременно свойствами как анионов, так и катионов. В нейтральной области рН большинство аминокислот являются цвиттер-ионами. Так молекула гистидина (рис. 3–31 а) находится в цвиттер-ионном состоянии при рН=7,6.

Аминокислоты, изменяющие зарядовое состояние вблизи рН~7, имеют особое значение. Именно такие аминокислоты, легко перезаряжаемые вблизи значения рН, характерного для жизнедеятельности белка, играют важную функциональную роль в активных центрах белков.

В качестве примеров, на рис. 3–32 и 3–33, приведены химические формулы некоторых аминокислот и в скобках указаны значения рК у заряжающихся групп. Изображенные на рис. 3–33 аминокислоты, имеющие группы: ОН, СН_2, СН₃ , относятся к группе гидрофобных аминокислот.

Для сравнения зарядового состояния кислот разных классов на рис. 3–34 представлены зависимости от рН среды суммарного заряда ( ) основной аминокислоты (гистидина), нейтральной (треонина) и кислой (аспарагиновой кислоты), а также отмечены значения рК для отдельных заряжающихся групп этих аминокислот.

(а)

(б)

Рис. 3–31. Зависимость суммарного заряда q_Σ гистидина (а) и глицина (б) от рН среды. При повышении рН среды заряд гистидина изменяется от +2е до –е, глицина от +е до –е. В верхней части рисунка изображены зарядовые состояния (четыре для гистидина с суммарным зарядом +2е, +е, 0, –е и три для глицина с суммарным зарядом +е, 0, –е). Выделенными точками показаны значения рК для отдельных групп гистидина (СООН, NH₂ и имидазольного кольца) и глицина (СООН, NH₂)

Рис. 3–32. Заряженные аминокислоты белков при рН = 7 кислые: (а) – аспарагиновая и (б) – глутаминовая кислоты и основные: (в) – аргинин, (г) – лизин, (д) – гистидин. В скобках указаны значения рК (депротонизации) соответствующих групп. В рамках выделены части молекул, одинаковые для всех аминокислот

Рис. 3–33. Гидрофобные аминокислоты: (а) – пролин, (б) – валин, (в) – 4-гидроксипролин

Рис. 3–34. Зависимость заряда аминокислот: гистидина, треонина и аспарагиновой кислоты, от значения рН среды. Выделены точки, соответствующие рК заряжающимся группам: СООН, NH₂ и N в имидозольном кольце

Благодаря цвиттерионному строению аминокислоты способны в растворах действовать как буферы рН, то есть поддерживать значение рН вблизи рН=7. При повышении рН (уменьшении концентрации ионов Н⁺ в растворе) они выступают в роли доноров Н⁺ а при понижении (увеличении концентрации Н⁺) – в роли акцепторов Н⁺ (рис. 3–35)

Рис. 3–35. Влияние уменьшения рН (+Н+) и увеличения рН (–Н+) раствора на ионное состояние аминокислоты

Чтобы заряженная группа могла проникнуть в неполярную гидрофобную среду, например, вглубь мембраны или молекулы белка, требуется энергия в несколько десятков ккал/моль. Если же эта группа переходит в незаряженное состояние, то энергия, необходимая для проникновения в неполярную среду снижается до незначительной величины. Естественно, что при этом надо учитывать энергию, которая затрачивается на изменение заряда данной группы. Оценим эту энергию.

Вероятность состояния и энергия этого состояния связаны больцмановским соотношением , где А – константа, определяемая из условия нормировки. Если рассматривать только два состояния (заряженное и незаряженное), а энергию отсчитывать от незаряженного состояния, то условие нормировки запишется в виде:

или

,

т. е.

. (3.6)

Тогда вероятность заряженного состояния равна

. (3.7)

Из (3.7) можно выразить свободную энергию F^– отрицательно заряжающейся группы, используя для w^– выражение (3.2), и свободную энергию F⁺ положительно заряжающейся группы, используя для w⁺ соотношение (3.3):

(3.8)

. (3.9)

В области рН = 7, полагая для оценки рК – рН ≈ 2, получаем, что , то есть не превосходит нескольких ккал/моль. Таким образом, энергия перезарядки боковых групп и соответствующих им аминокислот близка к энергии водородных связей.