Фотометрическая оксиметрия (подробно)
В исследовании оксигенации крови широко используется методика спектрофотометрии, заключающаяся в измерении поглощения света, прошедшего через пробу крови в различных спектральных диапазонах. Количественная спектрофотометрия крови основана на использовании закона Вееr-Lambert ( B-L ) для растворов, который связывает интенсивность падающего (Iпад) и интенсивность проходящего (Iпр) сквозь исследуемую пробу света (рисунок 7):
v
Iпр = Iпад ехр ( – А),
Рисунок 7 – К закону Вееr-Lambert.
где А = k [С] d - величина абсорбции (поглощения); здесь k - коэффициент молярной экстинкции, постоянный для каждого вещества и длины волны падающего света; [C] - концентрация поглощающего свет вещества; d - толщина слоя поглощающего вещества.
Поглощение света для постоянной толщины слоя исследуемого вещества, определяемого, например, размером измерительной кюветки, зависит от коэффициента экстинкции и пропорционально концентрации поглощающего вещества. Зависимость коэффициента экстинкции от длины волны падающего света образует спектр поглощения вещества. Для n-компонентных растворов суммарная абсорбция Аj, измеренная на длине волны излучения Lj может быть представлена в виде
Данное выражение позволяет определить концентрации веществ-компонентов раствора [Сi], измеряя величину абсорбции на различных длинах волн света, для которых коэффициенты экстинкции исследуемых веществ известны. В этом случае выражение для суммарной абсорбции дает систему уравнений (j = [1,m], где m - количество используемых в измерениях длин волн света), имеющее решение при m>n. Исследование оптических свойств крови с целью определения степени ее оксигенации показывает, что каждая форма гемоглобина имеет свой собственный спектр поглощения (рисунок 8). Так, НbО2 имеет минимум поглощения в красной части спектра, где поглощение редуцированного Нb выше; в инфракрасной (ИК) части спектра поглощения НbО2 становится несколько выше поглощения Нb. СОНb имеет резко падающую зависимость поглощения и в ИК области его поглощение незначительно. МеtНb имеет более сложную зависимость поглощения от длины волны излучения, однако можно выделить характерные участки спектра, где оптические свойства МеtНb существенно отличаются от свойств других форм гемоглобина.
Рисунок 8 – Зависимость поглощения света от длины волны излучения для различных форм гемоглобина
Для измерения концентрации всех четырех форм гемоглобина необходимо провести измерения поглощения света, по крайней мере, на четырех длинах волн. Для целей клинической оксиметрии можно предположить, что концентрация фракций СОНb и МеtНb мала по сравнению с концентрацией НbО2 и Нb, тогда функциональную сатурацию артериальной крови можно определить с помощью измерений только на двух длинах волн света. Для определения фракционной сатурации необходимо использовать четыре длины волны излучения, чтобы дополнительно найти концентрации МеtНb и СОНb. Достоинством данного метода является то, что обеспечивается быстрота получения результатов, достаточная точность измерения. Но недостаток заключается в том, что при определении коэффициента поглощения необходимо учитывать толщину крови или предварительно разводить ее плазмой. Чтобы исключить эти недостатки, было предложено определять не коэффициент поглощения, а коэффициент отражения. А т.к содержится две составляющих, для выделения и конкретизации одной предложено использовать двухчастотный метод определения кислорода в крови, что позволит повысить точность и уменьшить погрешность измерения.
Замечание 1 (справочное)
Зако́н Бугера — Ламберта — Бера — физический закон, определяющий ослабление параллельного монохроматического пучка света при распространении его в поглощающей среде.
Закон выражается следующей формулой:
,
где I0 — интенсивность входящего пучка, l — толщина слоя вещества, через которое проходит свет, kλ — показатель поглощения.
Показатель поглощения — коэффициент, характеризующий свойства вещества и зависящий от длины волны λ поглощаемого света. Эта зависимость называется спектром поглощения вещества.
Для растворов поглощающих веществ в непоглощающих растворителях показатель поглощения может быть записан как
kλ = χλC,
где χλ — коэффициент, характеризующий взаимодействие молекулы поглощающего вещества со светом длины волны λ, C — концентрация растворённого вещества.
Утверждение, что χλ не зависит от C, называется законом Бера (не путать с законом Бэра). Его смысл состоит в том, что способность молекулы поглощать свет не зависит от состояния других окружающих молекул. Однако наблюдаются многочисленные отклонения от этого закона, особенно в случае больших концентраций C.
Иллюстрация закона Бугера — свет (интенсивности I0) проходит через раствор толщины l