Самостоятельная работа студентов

Определение метгемоглобина проводят спектрофотометрически при красном светофильтре (600-670 нм). Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия.

1. Подготовка проб к анализу.

Для анализа у исследуемых животных берут по 1-2 мл крови, помещают ее в пробирку и стабилизируют кровь, добавив туда 2-3 капли раствора гепарина или трилона Б, перемешивают раствор и закрывают пробирки пробками.

Анализ проб на содержание метгемоглобина лучше проводить непосредственно после доставки проб, но при необходимости стабилизированную кровь хранят в холодильнике при температуре 2-4 ⁰С.

Перед исследованием кровь тщательно перемешивают.

2. Проведение анализа.

В 2 пробирки наливают по 7,3 мл 0,25% раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка № 2) добавляют 1-2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, оставляют на 10 мин обе пробирки, а затем определяют величину оптической плотности обоих растворов, используя для сравнения 0,25% раствор аммиака.

В первой пробирке (пробирке № 1) определяют величину оптической плотности раствора крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (А₄ - ), или, что то же, гемоглобина, во второй (пробирка № 2) - величину оптической плотности раствора крови, в которой весь оксигемоглобин (НbО) превращен в метгемоглобин 2 (МetНb) - (А₅).

Как отмечено выше, содержание оксигемолюбина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.

Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка № 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощения раствора с содержанием метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина (оксигемоглобина).

3. Расчет результатов анализа

Предварительно опытным путем на большой группе животных двух видов установлена средняя величина оптической плотности раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (А_НbО), и средняя величина светопоглощения раствора крови с полученным уровнем метгемоглобина (А_МetНb) для овец и коров.

В пробах крови овец первая величина (А_НbО) составила 0,15, вторая (А_МetНb) - 0,57; для крупного рогатого скота эти величины составляют соответственно 0,17 и 0,79.

Поскольку гемоглобин в пробе крови полностью переводится в метгемоглобил добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,42 (0,57-0,15) для овец и 0,62 (0,79-0,17) для крупного рогатого скота, соответствует 100 % содержания метгемоглобина.

Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови животных по данной методике.

По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка № 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка № 2) и рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенным формулам, используя установленные коэффициенты и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн:

(1) для овец

(2) для крупного рогатого скота

где Х – содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %;

А₂ - приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (расчет приводится ниже);

А₁ - среднее значение величины светопоглощения раствора оксигемоглобина, равное 0,15 для овец и 0,17 для крупного рогатого скота;

2,38 и 1,61 - расчетные коэффициенты, найденные из средних величин светопоглощения растворов оксигемоглобина и метгемоглобина для овец и крупного рогатого скота (расчет их также приводится далее).

Значение А₂ - приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (А_НbО2 ) - находят из пропорции с использованием измеренных величин оптической плотности раствора крови с исходным содержанием оксигемоглобина (пробирка № 1) и метгемоглобина (пробирка № 2) в опыте.

, отсюда ,

где А₂ - искомая величина - приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина;

А₃ - среднее значение оптической плотности раствора метгемоглобина, соответственно 0,57 для овец для расчета и 0,79 для крупного рогатого скота в формулу (2);

А₄ - измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (пробирка № 1);

А₅ - измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина (пробирка № 2) .

Значение А₂ подставляют в формулу (1) или (2) для расчета содержания метгемоглобина в крови овец или крупного рогатого скота.

Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (А₂) будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора оксигемоглобина (А₁ в формулах 1 и 2), что объясняется индивидуальными колебаниями содержания гемоглобина в крови, содержание метгемоглобина в крови в этом случае будет равно или меньше 2,38 для овец и 1,61 для крупного рогатого скота.

Коэффициенты 2,38 и 1,61. были рассчитаны из средних показателей оптической плотности растворов метгемоглобина и оксигемоглобина в крови овец и коров соответственно по формулам:

(для овец) ; (для коров)

где 0,42 - изменение светопоглощения растворов крови овец с содержанием мет- и оксигемоглобина (0,57 - 0,15), соответствующее 100% -ого содержанию метгемоглобина в крови овец 0,01 - наименьший показатель оптической плотности, т. е.

Подобным образом рассчитан и коэффициент для крупного рогатого скота.