Вспомогательные материалы по теме.

ГЕНОИНДИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний представляет собой одну из важнейших задач микробиологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, начиная от классических методик микробиологического тестирования и заканчивая иммунохимическими и молекулярно-биологическими методами. В каждом случае характер и сложность диагностических приемов зависят от биологии искомых возбудителей инфекции, которые претерпевают адаптивные изменения под воздействием экологических факторов, антибактериальной терапии и т.д.

Поэтому в последние годы все чаще и чаще традиционные, а порой и недавно наиболее перспективные методы диагностики оказываются недостаточными или принципиально неприменимыми. В связи с этим в настоящее время при проведении диагностических исследований стремятся к выявлению в исследуемых образцах специфических фрагментов нуклеиновых кислот патогенов.

Одним из наиболее часто применяющихся с этой целью методов является гибридизация специфических последовательностей нуклеиновых кислот (зондов) с фрагментами генома искомых патогенов, с помощью которой проводят обнаружение в исследуемых образцах, идентификацию возбудителей до вида, рода или семейства, дифференцируют патогенные и непатогенные штаммы одного вида (токсигенные и нетоксигенные Escherichia coli. Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica и т.д.). Зонды представляют собой меченные радиоактивными (³²Р, ³⁵S, ¹²⁵J) или хромогенными (фотобиотин, аминолинк) метками одноцепочные участки нуклеиновых кислот (в большинстве случаев ДНК) длиной, как правило, 32-37 нуклеотидов, которые связываются с комплементарными последовательностями в процессе реассоциации ДНК. Эти последовательности, в зависимости от типа используемых гибридизационных проб, могут быть обнаружены в геноме штаммов одного или близко родственных видов либо в гомологичных генах изолятов различных видов (например, гены, кодирующие синтез термолабильных энтеротоксинов E.coli и V.cholerae, R-плазмиды Serratia и Klebsiella spp.).

Искомые последовательности доступны обнаружению, даже если они составляют 0.001% генома возбудителя. При этом не требуется обязательного изолирования чистой культуры патогенов, и процесс идентификации в различных клинических биосубстратах занимает от 6 до 48 ч. Чувствительность метода составляет от 2х10³ до 1х10⁶ КОЕ/мл, специфичность гибридизации очень высока (0,5-0,8% ложноположительных результатов).

Вместе с тем достаточно сложная техника проведения экспериментов по гибридизации с использованием радиоактивно меченых проб препятствует широкому внедрению метода в диагностические лаборатории. Поэтому в последнее время широкое применение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на многократном копировании выбранной нуклеотидной последовательности генома с помощью ДНК-полимеразы, синтезирующей взаимно комплементарные цепи ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок), комплементарных противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих последовательность-мишень и ориентированных 3' и 5'-концами навстречу друг другу. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются во вновь образуемые молекулы ДНК, и каждая из таких цепей, синтезированных с помощью одного из праймеров, может служить матрицей для синтеза комплементарной нити с помощью другого праймера. Для этого лишь надо денатурировать образовавшиеся на первой стадии реакции двухцепочечные молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить элонгацию. Эти три стадии составляют цикл ПЦР и приводят к удвоению количества ДНК в образце.

Любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза новых молекул ДНК, поэтому они будут соответствовать по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации. Эти молекулы образуются уже после второго цикла ПЦР, а в последующих циклах будет происходить экспоненциальный рост числа именно таких, ограниченных с двух концов праймерами, молекул ДНК. Их количество определяется формулой (2ⁿ-2n)х, где n - число циклов ПЦР, 2n - количество ПЦР-продуктов неопределенной длины, синтезируемых постоянно, но "разбавляемых" в ходе реакции, x - первоначальное количество копий матрицы в образце.

Следовательно, теоретически за 20 циклов ПЦР можно амплифицировать 2²⁰ (около 10⁶) копий заданного участка ДНК, что позволяет теоретически обнаруживать единственную молекулу искомой ДНК в образце. Для получения удовлетворительных результатов исследования, как правило, достаточно провести 27-30 циклов ПЦР в связи с тем, что к этому моменту накопление ДНК-продукта из экспоненциального становится линейным из-за истощения пула нуклеотидов, праймеров, инактивации полимеразы, конкуренции со стороны неспецифических продуктов амплификации и от прочих причин. Выявление амплифицируемых фрагментов осуществляют, как правило, путем их разделения методом гель-электрофореза и визуализации в УФ свете после окрашивания этидием бромида или посредством ДНК-ДНК-гибридизации с внутренним олигонуклеотидом (зондом).

Из схемы реакции становится понятным, что метод обладает широкими возможностями для обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний различной этиологии. Относительная простота постановки, быстрота, высокая чувствительность и специфичность придают полимеразной цепной реакции значительные преимущества при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также при выявлении микроорганизмов, культивирование которых слишком длительно и трудоемко, а различные варианты иммунохимической диагностики (серологическое тестирование, иммуноферментный анализ, метод флюоресцирующих антител не вполне надежны. Этим методом удается обнаруживать около 100 м.к./мл в пробе с применением для визуализации результатов электрофореза в агарозном геле или 1-25 клеток при использовании с этой целью дот-гибридизации. Незаменима ПЦР при обнаружении вирулентных штаммов бактерий, достигаемом путем амплификации (фрагментов генов, кодирующих различные факторы вирулентности (tox - ген Corynebacterium diphtheriae. inv - ген Y.enterocolitica). Для исследования с использованием ПЦР при выявлении патогенных микроорганизмов доступны не только свежевзятые образцы (биоптаты и т.д.), но и замороженные, фиксированные этанолом или формалином пробы.

Полимеразная цепная реакция - единственный на настоящее время методический подход, способный доказать присутствие в образце обладающих патогенным потенциалом некультивируемых форм микроорганизмов с последующей их идентификацией путем амплификации, к примеру, генов 16S рРНК, их секвенирования и последующего сравнения полученных результатов с нуклеотидными последовательностями аналогичных генов известных микроорганизмов. Таким образом были идентифицированы возбудители бациллярного ангиоматоза Rochalimaea henselae, болезни Виппла - актиномицет Tropherima whippelii. В настоящее время с использованием ПЦР ведется поиск предполагаемых ранее инфекционных агентов - возбудителей саркоидоза, заболевания Крона, малакоплакии, хронического возвратного остеомиелита.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Выявление фенотипической изменчивости (модификации)

Изучают колонии Proteus mirabilis, выросшие на питательном агаре в чашке Петри через 24 ч после посева разведенной культуры. Отмечают, что все колонии протея окружены зоной роения. Пересевают все колонии петлей на поверхность питательного агара с 1% сухой желчью в чашки Петри и инкубируют при 37°С 18-24 ч. Все колонии протея, выросшие на питательном агаре с желчью, не имеют зон роения. Вновь пересевают каждую колонию в чашку Петри с питательным агаром и инкубируют при 37°С 18-24 ч. Наблюдают, что все колонии, выросшие на питательном агаре, окружены зоной роения.

Изменение фенотипа протея на питательной среде с желчью (утрату роения) следует считать модификацией, т.к. налицо все три ее отличительных признака:

• определенность (связь отсутствия роения с определенным фактором - желчью),

• общность изменений (утрата роения наблюдается у всех изученных клеток или колоний популяции),

• обратимость (при отсутствии желчи в питательной среде восстанавливается исходный фенотип).

Выявление мутантов-бактерий и доказательство спонтанности мутаций тестом перераспределения

В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл суточной бульонной культуры E.coli М-17 (посевная доза 1х10⁸ бактерий) и равномерно распределяют шпателем по поверхности питательной среды. Через 6 ч инкубации при 37°С в одной из чашек перераспределяют шпателем популяцию бактерий (микроколонии) по поверхности питательной среды, а другую чашку оставляют нетронутой. Выросшие через 24 ч бактерии пересевают из каждой чашки методом отпечатков с помощью штампа-репликатора на поверхность питательного агара с рифампицином (100 мкг/мл) в отдельные чашки Петри и инкубируют при 37°С. Через 24 ч учитывают результат:

• на поверхности среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии рифампицинрезистентных мутантов,

• в чашке с перераспределением посевов выросли более многочисленные (в десятки - сотни раз) колонии антибиотикоустойчивых мутантов.

Перераспределение бактерий шпателем на поверхности питательной среды без антибиотика не оказывает влияния на число бактерий. Если допустить, что антибиотикоустойчивые мутанты возникают в результате индукции антибиотиком, то после перераспределения и без него на питательной среде с антибиотиком должно вырасти одинаковое число колоний антибиотикоустойчивых мутантов. Если же антибиотикоустойчивые мутанты возникают спонтанно и в отсутствии антибиотика, то результат будет иной. Уже в первой инкубации (через 6 ч) на среде без антибиотика на чашках появляются микроколонии антибиотикоустойчивых клеток-мутантов. Благодаря перераспределению бактерии-мутанты из этих микроколоний распространяются по всей поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения выявляют только небольшое число колоний, соответственно исходным микроколониям мутантов. Полученный в данном опыте результат доказывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли спонтанно до контакта бактерий с селективным агентом рифампицином.

Постановка опыта конъюгации

Донор: E.coli К-12 HfrC Leu⁺ Thr⁺ Sm^s Реципиент: E. coli C-600 Leu^- Thr^- Sm^r. Селективная среда для выделения рекомбинантов: максимальная среда, содержащая NH₄Cl - 5 г, NH₄NO₃ -1 г, Na₂SO₄ - 2 г, К₂НРО₄ - 3 г, KH₂PO₄ - 1 r, MgSO₄x7H₂0 - 0,1 г, глюкозу - 2 г, агар-агар -15 г, дистиллированную воду до 1 л, стрептомицин 200 ЕД/мл.

К 4,5 мл суточной бульонной культуры реципиента добавляют 0,5 мл суточной бульонной культуры донора и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем делают разведения смеси физиологическим раствором от 10^-1 до 10^-5 и высевают по 0,1 мл на селективную среду в чашки Петри (на среде могут вырасти только колонии бактерий рекомбинантов, ставших прототрофами в результате получения генов Leu и Thr донора). В качестве контроля на ту же среду засевают раздельно по 0,1 мл культуры донора и реципиента. Они не должны расти на селективной среде, т.к. доноры чувствительны к стрептомицину, а реципиенты - ауксотрофы по лейцину и треонину. Для определения числа жизнеспособных клеток донора разводят его культуру физиологическим раствором и высевают из разведении l0^-6-l0^-7 по 0,1 мл на селективную среду без стрептомицина. Все посевы инкубируют при 37°С 24-48 ч.

После подсчета выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению числа рекомбинантов к числу донорских клеток. Например, после посева 0,1 мл смеси в разведении 10^-4 на селективной среде выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры донора в разведении 10^-6 выросло 75 колоний. Следовательно, частота рекомбинантов будет:

1,5х10⁷ / 7,5 10⁸=2х10^-2.

Выявление конъюгативных R-плазмид

Испытуемые бактерии: клинические штаммы антибиотикорезистентных шигелл Зонне. Реципиент: штамм E. coli W 1655 Tra^- Lac⁺ Nl^r сохранивший видовую чувствительность к антибиотикам и имеющий нетрансмиссивную хромосомную устойчивость к налидиксовой кислоте. Питательная среда для определения детерминант приобретенной антибиотикоустойчивости: среда Эндо, содержащая раздельно антибиотики - тетрациклин (64 ЕД/мл), левомицетин (64 мкг/мл), стрептомицин (128 ЕД/мл), канамицин (128 ЕД/мл), ампициллин (256 ЕД/мл). Селективная среда для выделения антибиотикоустойчивых рекомбинантов - указанная среда с антибиотиками, содержащая дополнительно к каждому антибиотику налидиксовую кислоту (64 мкг/мл).

Для выявления детерминант антибиотикоустойчивости засевают петлей суточные бульонные культуры щигелл Зонне на секторы сред Эндо с различными антибиотиками и без антибиотиков (контроль).

На каждую чашку делают посев 4-12 штаммов путем нанесения одной петли культуры радиальным штрихом. С целью изучения трансмиссивности детерминант антибиотикоустойчивости путем конъюгации вносят по 0,5 мл тех же культур Зонне (доноры) в пробирки с 4 мл бульона Хоттингера и добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл суточной бульонной культуры эшерихий (реципиента), т.е. для каждого штамма шигелл используют одну пробирку. Посевы инкубируют при 37°С.

Через 24 ч учитывают антибиотикорезистограммы. Шигеллы Зонне имеют детерминанты приобретенной антибиотикоустойчивости к тем антибиотикам, на средах с которыми выросли сплошным газоном или отдельными колониями по ходу посева, и чувствительны к тем антибиотикам, на средах с которыми роста нет. В это же время делают высев из пробирок с конъюгационной смесью бактерий на секторы селективных сред для выделения антибиотикоустойчивых рекомбинантов. Высев из смеси делают конкретно для каждого штамма шигелл только на селективные среды с теми антибиотиками, устойчивость к которым обнаружена при определении детерминант антибиотикорезистентности. Методика посева на секторы сред идентична уже описанной. Чашки с посевами инкубируют при 37°С 24 ч, после чего учитывают результаты. Шигеллы Зонне имеют трансмиссивные детерминанты устойчивости к тем антибиотикам, на селективных средах с которыми вырастают газонами или отдельными колониями темно-красного цвета рекомбинанты кишечной палочки. Отсутствие роста рекомбинантов на селективных средах с антибиотиками свидетельствует о нетрансмиссивности детерминант устойчивости к этим антибиотикам. Конъюгативная трансмиссивность комплекса детерминант антибиотикоустойчивости с большой вероятностью указывает на их принадлежность к конъюгативной R-плазмиде.