Индикаторы

Индикаторы, меняющие свой цвет при изменении рН среды, вводят в состав специальных сред, которые служат для выявления биохимических свойств микробов. Изменение цвета среды указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной деятельно­сти микробов. Известны индикаторы, приобретающие ту или иную окраску лишь при щелочной или кислой реакции; вне этой реакции они бесцветны – индикатор Андреде (красный в кислой среде при рН 6,5-7,2, в щелочной бесцветный); фенолфталеин (красный в щелочной среде при рН 8,3-10,0, в кислой бесцветный); фуксин (вишнево-красный в кислой среде в границах рН 7,4-7,7, в щелочной бесцветный).

Более удобны двухцветные индикаторы, имеющие разную окрас­ку в кислой и щелочной среде. Лакмусовая настойка, например, при кислой реакции приобретает розовую окраску, при щелочной – си­нюю. Часто применяют розоловую кислоту, которая в кислой сре­де – до рН 6,2-6,5 – имеет желтую окраску, а начиная от рН 6,5 приобретает бледно-розовый цвет, переходящий в интенсив­но-розовый при щелочной реакции (начиная от рН 7,2). Наиболее широко распространены индикаторы Кларка. Они имеют различную окраску в кислой и щелочной среде, а также хорошо выраженные переходные тона. Кроме того, диапазон чувствительности этих индикаторов весьма широк (таблица).

Предложен ряд комбинированных индикаторов, которые удобны в тех случаях, когда оттенки перехода от одного цвета к другому при изменении рН в определенных границах у од­ного индикатора недостаточно отчетливы. В сухих питательных средах применяют индикатор BP – смесь водного голубого и розо­ловой кислоты. В кислой среде он имеет синюю окраску, в щелоч­ной – красную, при нейтральной реакции – бесцветен. Индикатор действует в пределах рН 4,5–8,0.

Комбинированный индикатор Равич-Биргера и Мешалова (100 мл р-ра Андреде +0,4 г тимоло­вого синего )характеризуется оранжевым цветом в кислой среде (не ниже рН 3,0), желтым – в нейтральной и слабощелочной, фиолетовым – в щелочной среде.

Универсальный индикатор (Шосткинского завода химреактивов) представляет собой смесь нескольких индикаторов и имеет розово-красную окраску при рН 2,0, оранжевую – при рН 3,0–4,0, желтую – при рН 5,3–6,7, зеленую – при рН 6,9–8,0, синюю – при рН 9,0 и выше. Диапазон чувствительности этого индикатора очень широкий – от рН 2,0 до рН 9,0, но точность невелика (около 1,5–2,0 единиц рН). Поэтому его используют лишь для ориентировочного определения. Способ приготовления указан на этикетке.

Наиболее распространенные индикаторы Кларка

Индикатор

РН

Изменение окраски в границах рН

Кон­цен­трация рабо­чего раство­ра, %

ниже 3,0

5,3

5,5

6,0

6,25

6,5

6,7

6,9- 7,0

7,2 - 7.4

7,7

8,0

9,0-12,0

Феноло­вый красный

Оран­жевый

Оран­жевый

Светло-оранжевый

Темно-желтый

Жел­тый

Светло-желтый

Лимонно-желтый

Крас­ный

Малиновый

5,5–7,7

0,02

Метиловый красный

Резко-красный

Розовый

Светло-розовый

Лимонный

4,4–6,0

0,02

Крезоловый красный

Лимонно-желтый

Желтый

Бледно-розовый

Розо­вый

Мали­новый

7,8–8,0

0,02

Бромкрезоловый пурпур­ный

Лимонно-желтый

Слегка фиоле­товый

От слабо-фиолетового до интенсивно-фиолетового

Синий с фиолето­вым от­тенком

6,0–9,0

0,04

Бромтимоловый синий

Лимонно-желтый

Лимонный

Зелено­ватый

Бледно-зеленый

Зеле­ный

Синий с зелено­ватым оттенком

Густо-синий

6,25–7,7

0,04

Тимоло­вый синий

Лимонно-желтый

Желтый с фиолетовым оттенком

Фиолето­вый

7,4 –9,0

0,04

Способы приготовления различных индикаторов.

Розоловая кислота. Этот индикатор применяют в виде спиртово-водного раствора: 0,1 г розоловой кислоты растворяют в 10 мл чистого спир­та, а затем добавляют 70 мл дистиллированной воды.

Индикатор Андреде: кислого фуксина 1 г, дистиллиро­ванной воды 400 мл, раствора едкого натра 64 мл. После приготов­ления сутки выдерживают в термостате, 2 сут на свету. Сохраняют в темной бутыли. В кислой среде краснеет.

Индикаторы Кларка. Готовят в виде спиртовых и вод­ных растворов. Спиртовые растворы (1,6%) используют при приго­товлении специальных питательных сред. Для определения реакции применяют водные растворы, так как они более чувствительны, чем спиртовые. Для приготовления водного раствора 0,1 г индикатора в порошке перетирают в агатовой ступке с 1/20 N раствором едкого натра. Разные индикаторы растворяют в разных количествах едкого натра: для фенолового красного требуется 5,7 мл, для метилового красного – 7,4 мл, для крезолового красного – 5,3 мл, для бром-крезолового красного – 3,7 мл, для бромтимолового синего – 3,2 мл, для тимолового синего – 4,3 мл.

После растворения добавляют воды до 25 мл и получают 0,4% основные растворы, которые хранят впрок. Для определения реак­ции основные растворы разводят дистиллированной водой соответ­ственно концентрации рабочего раствора (0,04–0,02% и т. д.).

Для определения пути расщепления глюкозы (окислительный или бродильный) ставят тест ОФ (тест окисления/ферментации): культуру засевают уколом в две пробирки с полужидкой ПС, содержащей глюкозу и бромтимоловый синий. В одну из них вносят слой вазелинового масла (для создания анаэробиоза) и инкубируют обе пробирки при 37 °С. Образование кислоты, сопровождающееся пожелтением среды в обеих пробирках, свидетельствует о ферментативной реакции. Образование кислоты только в пробирке без масла свидетельствует об утилизации глюкозы путем окисления. Отсутствие кислотообразования в обеих пробирках свидетельствует о том, что тестируемые микроорганизмы не утилизируют глюкозу этими путями (см. цв. вклейку, рис. 9). В двух последних случаях микроорганизмы могут относиться к «неферментирующим» видам – Acinetobacter, Alcaligenes, Burkholderia, Flavimonas, Flavobacterium, Pseudomonas и др.

Для выявления микробной нитратредуктазы ставят тест на восстановление нитрата в нитрит (последний в присутствии N,N-диметил-1-нафтиламина образует диазосоединение, которое окрашивает среду в красный цвет). Культуру выращивают на полужидкой среде, содержащей 0,1 % нитрата, и добавляют смесь указанного реактива с сульфаниловой кислотой, наблюдая в течение нескольких минут за развитием красного окрашивания среды (свидетельствует о присутствии нитрита).

Для определения каталазы на поверхность 24-часовой культуры на скошенном агаре наливают 0,5– 1,0 мл 3%-го раствора перекиси водорода (нельзя использовать кровяной агар, так как катализа эритроцитов может дать ложноположительную реакцию). Появление пузырьков газа расценивают как положительную реакцию. В качестве контроля следует параллельно исследовать культуру, заведомо содержащую каталазу.

Биохимические свойства большого количества культур аэробных и анаэробных бактерий нередко изучают с применением специальных микротестсистем и микробиологических анализаторов. Как правило, для этого используют полистироловые пластины с изолированными лунками, содержащими высушенные дифференциально-диагностические среды. При внесении небольшого количества стандартизованной суспензии испытуемой чистой культуры среда в лунках восстанавливается, а при последующем инкубиро–вании в термостате культура вырастает в лунках, проявляя свои характерные изменения на соответствующих средах.

Анализатор отличается от мультимикротестов тем, что учет, а в ряде приборов также посев и инкубирование осуществляется автоматически (мутность и цветовые изменения среды в каждой лунке регистрируются с помощью встроенного спектро–фотометра).

Антигенные свойства выделенной культуры изучают, как правило, с помощью реакции агглютинации.

Вирулентность определяют путем выявления факторов патогенности, путем заражения экспериментальных животных, культур ткани или на экспериментальных моделях.

Для определения чувствительности к антимикробным средствам культуру засевают на жидкие и плотные среды в соответствии с принятыми методами исследования.

Характерные свойства бактерий, имеющие значение для их идентификации, приведены в разделах, посвященных лабораторной диагностике вызываемых ими заболеваний.

В отдельных случаях для выделения чистой культуры возбудителя (чума, туляремия и др.) применяется биологическая проба.

Анаэробные бактерии. Одним из основных требований при куль–тивировании анаэробных бактерий является создание анаэробной атмосферы, удаление кислорода из питательной среды и сниже–ние ее редокс-потенциала. Пониженное содержание кислорода создают следующими методами:

применением специальных сред с редуцирующими вещества–ми – тиогликолевой кислоты, тиогликолята натрия, цистеина, глюкозы, кусочков печеночной (среда Китта–Тароцци) и моз–говой (среда Гиблера) ткани, мяса и др.;

связыванием или замещением кислорода в герметически зак–рытых сосудах – анаэростатах, эксикаторах или специальных пла–стиковых мешках (рис. 1.7);

изоляцией анаэробов в питательной среде от воздействия ат–мосферного кислорода (посев высоким столбиком в трубку или пробирку, заливка вазелинового масла на поверхность питатель–ной среды, метод Перетца и др.);

использованием специальных анаэробных боксов (см. цв. вклей–ку, рис. 11).

На первом этапе исследуемый материал для накопления анаэробов сеют в среду Китта–Тароцци (концентрированный

3*

35

Герментизирующая крышка

Анаэробный контейнер

Газогенераторный пакет

Посевы в чашках Петри

МПБ или бульон Хоттингера, глюкоза, 0,15 % агар-агара, рН 7,2 – 7,4). На дно пробирки для адсорбции кислорода помещают кусоч–ки вареной печени или фарша слоем 1,0 – 1,5 см и заливают 6 – 7 мл среды. Среду перед посевом необходимо прогреть в кипящей водяной бане в течение 10 – 20 мин (для удаления растворенного в ней кислорода воздуха), а затем охладить. При выделении спо–ровых форм анаэробов засеянную среду вновь прогревают при тем–пературе 80 "С в течение 20–30 мин для уничтожения неспоровых форм бактерий. Посевы заливают вазелиновым маслом и помеща–ют в термостат. Кроме среды Китта–Тароцци, используют буль–он Хоттингера и Мартена, содержащий 0,5–1,0 % глюкозы и ку–сочки органов животных, тиогликолевую среду и др.

Например, тиогликолевая среда состоит из гидролизата казеи–на – 15, дрожжевого и/или мясного экстракта – 5, глюкозы – 5,5, хлорида натрия – 2,5, L-цистеина и тиогликолята натрия – по 0,5, резазурина – 0,001, агар-агара – 0,75. Среду разливают в пробирки или флаконы, стерилизуют при 121 °С 15 мин и хранят в темном месте. В случае покраснения верхней части столбика среды более чем Уз, ее восстанавливают путем прогревания в кипящей водяной бане или в струе пара.

На втором этапе учитывают изменения, происшедшие в среде накопления, а именно появление помутнения или помут–нения и газообразования. Бульонную культуру набирают пасте–ровской пипеткой, которую опускают через слой вазелинового масла на дно пробирки. Мазки готовят на стекле обычным спосо–бом, фиксируют в пламени и окрашивают по Граму. При микро–скопии отмечают морфологические признаки спорообразующих и неспорообразующих анаэробов (так, наличие крупных грампо-ложительных палочек позволяет заподозрить присутствие в мате–риале клостридий). Пересев из среды накопления делают на спе–циальные плотные питательные среды для анаэробов. Изолиро–ванные колонии обычно получают одним из двух нижеописанных способов.

1. М атериал со среды накопления засевают штрихами (или шпа–телем) на чашки с кровяным анаэробным агаром, которые поме–щают в анаэростат или другие приспособления для культивирова–ния анаэробов и инкубируют при 37 °С 24 ч – 72 ч (метод Цейс-слера).

2. Выращивают анаэробные микроорганизмы в глубине плот–ной питательной среды (метод последовательных разведений Вейнберга). Культуру из среды берут пастеровской пипеткой с запаянным концом и переносят последовательно в 1, 2 и 3-ю пробирки с 10 мл ИХН. Затем продолжают производить разведе–ния в пробирках из тонкого стекла диаметром 0,8 см и высотой 18 см, перенося материал в 4, 5 и 6-ю пробирки с расплавлен–ным и охлажденным до 50 °С сахарным агаром или средой Виль–сона – Блера. После застывания агара посевы помещают в термо–стат. Для приготовления среды Вильсона –Блера к 100 мл рас–плавленного МПА, содержащего 1 % глюкозы, добавляют 10 мл 20%-го раствора сульфита натрия и 1 мл 8%-го раствора хлорида железа.

Рис. 1.9. Образец хроматограммы, полу–чаемой для идентификации анаэробов по составу и количеству летучих жир–ных кислот

На третьем этапе изучают образовавшиеся в чашках изолиро- ванные колонии и из наиболее ти- пичных делают мазки. Остаток ко- лонии засевают в среду Китта–Та- роцци. Из пробирок с сахарным агаром или средой Вильсона–Бле- ра колонии извлекают стерильной пастеровской пипеткой или вытал- кивают столбик агара паром при по- догревании дна пробирки (рис. 1.8). 1 2 3 4 5 6 И³ части колонии готовят мазки, а Время, мин ее остатки сеют в среду Китта–Та-

роцци для накопления чистой куль–туры и инкубируют при 37 °С. На четвертом этапе выросшую на среде Китта–Тароц–ци культуру проверяют на чистоту и идентифицируют по морфо–логическим, культуральным, биохимическим, антигенным и дру–гим свойствам (см. выше). Иногда для идентификации выделен–ных культур (или прямого обнаружения анаэробов в исследуемом материале) методом газожидкостной хроматографии определяют характерные метаболиты анаэробного «дыхания» – летучие жир–ные кислоты (рис. 1.9)

На пятом этапе учитывают результаты исследования и анализируют их.