Занятие № 7. Бактериологический метод исследования. Выделение чистых культур аэробов

Бактериологическое исследование основано на культивирова­нии бактерий на питательных средах, выделении чистой культу­ры возбудителя и ее идентификации.

Чистой культурой (ЧК) называют популяцию микроорганизмов одного вида, как правило, выращенную из изолированной колонии на плотной питательной сре­де. Разрешающая способность метода составляет в среднем 1000 кле­ток в 1 мл.

Известно, что возбудители инфекционных болезней в организме человека, животных и во внешней среде находятся преимуще­ственно в смеси с другими микроорганизмами (в том числе услов­но-патогенными и сапрофитами). Выделение чистой культуры по­зволяет выявить ее морфологические, культуральные, биохими­ческие и другие признаки, по совокупности которых определяют видовую принадлежность возбудителя, т.е. осуществляют его иден­тификацию.

Существуют принципы и методы выделения чис­тых культур бактерий.

На принципе механического разобщения микроорганизмов основаны следующие методы:

• серийных разведений в жидкой питательной среде (метод Пастера);

• пластинчатых разведений (метод Коха);

• рассева по поверхности плотной ПС (метод Дригальского);

• выделения чистой культуры из одной клетки с помощью мик­роскопа и микроманипулятора.

На принципе использования биологических особенностей мик­роорганизмов основаны методы:

• выделения бактерий по их подвижности;

• выделения термоустойчивых бактерий;

• выделения анаэробов;

• выделения кислото- и щелочеустойчивых микроорганизмов;

• выделения микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам, анилиновым красителям и др.;

• выделения бактерий на элективных средах;

• выделения культур путем заражения восприимчивых лабора­торных животных и др.

Выбор метода культивирования, состава питательной среды зависит главным образом от типа питания и дыхания (биологи­ческого окисления) микроорганизмов.

2. Выделение и идентификация чк бактерий

Мы рассмотрим основные этапы выделения и идентификации ЧК аэробных и анаэробных бактерий. Методы выделения и идентификации конкретных возбудителей инфекционных заболеваний будут изучаться в соответствующих раз­делах частной микробиологии.

Схематично этапы выделения и идентификации ЧК аэробных и факультативных анаэробных бактерий представле­ны в таблице.

Принципиальная общая схема (алгоритм) бактериологического исследования

Этапы	Цель	Ход исследования
I	Выделение ЧК	Мазки по Гр. Посев исследуемого материала на плотные ПС
Инкубация посевов при оптимальных условиях (обычно 18-20 ч при 37 °С)
II	Накопление ЧК	Изучение культуральных свойств изолированных колоний Микроскопия окрашенных мазков (изучение морфологических и тинкториальных свойств) Пересев колоний на свежую среду для накопления
Инкубация посевов при оптимальных условиях (обычно 18-20 ч при 37°С)
III	Идентификация и изучение свойств ЧК	Проверка чистоты выделенной культуры. Изучение биохимиче ских свойств (ферментативной активности): сахаролитических; протеолитических Внутривидовая идентификация и эпидемиологическое маркирование (при необходимости): серотипирование; биотипирование; фаготипирование; колицинотипирование; генотипирование Определение токсигенности (вирулентности) Определение чувствительности к антибиотикам и другим антимикробным средствам
Инкубация посевов при оптимальных условиях (обычно 18-20 ч при 37 °С)
IV	Учет результатов

Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии

Первый этап –из исследуемого материала :

• приготовление мазков с окраской по Граму, микроскопия мазков;

• посев материала на плотную среду (МПА) в чашки Петри шпателем или бактериологической петлей для получения изолированных колоний →Т-т 37 °С, 24 ч.

При этом достигается механическое разъединение микроорганиз­мов на поверхности питательной среды, что позволяет получить их рост в виде изолированных колоний. В отдельных случаях иссле­дуемый материал вначале сеют в жидкую среду накопления, а затем пересевают его в чашки Петри с плотной ПС. Чашки с посевами обычно помещают в термостат на 18-24 ч при 37 °С.

Второй этап – изучение культуральных свойств бактерий (характер роста на питательных средах), посев для накопления чистой культуры:

• учет роста на плотной ПС (МПА) – макро- и микроскопическое изучение колоний;

• приготовление и микроскопия мазка (по Гр) из изолированной колонии;

• пересев изолированной колонии на скошенный агар (МПА) для накопления ЧК→Т-т 37  °С, 24 ч.

Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете. Чашку поворачивают дном к себе и рассматривают колонии в проходящем свете. При наличии различных видов колоний их нумеруют и описывают каждую в отдельности. Обращают внима­ние на следующие свойства: а) величину колоний (крупные – более 4 мм в диаметре, средние – 2 – 4 мм, мелкие – 1 – 2 мм, карликовые – менее 1 мм); б) форму очертаний колоний (пра­вильно и неправильно округлая, розеткообразная, ризоидная и др.); в) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).

В отраженном свете рассматривают колонии со стороны крыш­ки, не открывая ее, и фиксируют в протоколе следующие данные: а) цвет колоний (бесцветные, пигментированные, цвет пигмен­та); б) поверхность (гладкая, блестящая, влажная, морщинистая, матовая, сухая и др.); в) рельеф (выпуклые, погруженные в среду, плоские, с куполообразным центром, с валиком по краю и др.).

Микроскопическое изучение колоний. Чашку устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа, опускают конденсор и с помощью объектива 8× изучают колонии, фиксируя в протоко­ле их структуру (гомогенная или аморфная, зернистая, волокни­стая и др.) и характер краев (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и др.).

Из части колоний готовят мазки (при взятии материала из ко­лонии отмечают ее консистенцию – сухая, слизистая, пастообраз­ная), окрашивают по Граму и микроскопируют, выясняя тинкториальные свойства микроорганизмов. При наличии однородных бактерий остаток колоний пересевают на скошенный агар для получения чистой культуры в достаточном количестве. Пробирки с посевами помещают в термостат на 18 – 24 ч при температуре 37 °С.

Третий этап – определение чистоты выделенной культуры, пересев на «пестрый ряд» для последующей идентификации:

• мазок по Гр со скошенного агара для определения чистоты выделенной культуры:, заключение;

• пересев полученной ЧК со скошенного агара на МПА (подтверждение чистоты и накопление культуры); МПБ (для определения на аммиак, индол, сероводород) и среды короткого «пестрого» ряда для последующей идентификации →Т-т 37 °С, 18-24 ч.

О чистоте культуры в мазках по Гр судят по однородности роста, формы, размера и окраски микроорганизмов. Для последующей идентификации выделенной ЧК, кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей микроорганизмов, необходимо определить их ферментативные и антигенные свойства, фаго- и бактериоциночувствительность, токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую специфичность. Для определения биохимической активности (ферментативных свойств) полученную ЧК пересевают на «пестрый» ряд. Состав: МПА, поплавок, индикатор, углевод (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит и т.д.).

Четвертый этап – учет и анализ результатов исследования (ферментативной активности выделенной ЧК). Определение вида выделенной ЧК (идентификация) по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Заключение (ответ).

Теория

Видовую принадлежность аэробных бактерий определяют путем сравнения обнаруженных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств (чувствительность к фагам, бактериоцинам, а/б и т.д.) выделенной культуры со свойствами бактерий известных видов и вариантов. На четвертом этапе проводят учет результатов исследования, анализируют их и выписывают ответ по результатам посевов.

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы, используют дифференциально-диагностические среды Гисса. При ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты цвет среды меняется за счет находящегося в ней индикатора, что создает впечатление пестроты («пестрый» ряд). В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахарами (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза и др.), полисахаридами (крахмал, гликоген, инулин и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газообразные продукты (С0₂, Н₂, СН₄).

Протеолитические ферменты у бактерий обнаруживают различными способами, например, с помощью посева их в столбик питательного желатина. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20 – 22 °С) в течение нескольких дней, регистрируя не только наличие разжижения, но и его характер (послойно, в виде гвоздя, елочки и т.д.).

Протеолитическое действие ферментов микроорганизмов можно также наблюдать при посевах на свернутую сыворотку, при этом вокруг колоний появляются углубления (разжижение). В молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока).

Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода и других соединений. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы микроорганизмов в МПБ, 1%-ю пептонную или триптонную воду. Посевы выдерживают в термостате в течение 24–72 ч.

Для обнаружения индола по способу Ковача чистую культуру выращивают в пробирках на жидкой среде, богатой триптофаном, и добавляют несколько капель реактива Ковача (изоамиловый спирт – 150 мл, n-диметиламинобензальдегид – 10 мл, концентрированная соляная кислота – 50 мл). Индол, образовавшийся в ходе расщепления микробами триптофана, при взаимодействии с бензальдегидом образует окрашенные в красный цвет соединения – «розиндолы», поэтому при положительной реакции добавленная жидкость в течение нескольких минут становится малиново-красной.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой и пробкой пробирки. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца. В другом варианте в состав плотной среды вводят сульфат железа (П), который при взаимодействии с сероводородом образует черный преципитат сульфида железа (колонии образующих сероводород бактерий и среда вокруг них чернеют).