Качественные реакции на витамины. Количественное определение витамина с.

1. Витамин в1 (тиамин)

а) с диазореактивом

Принцип метода. Сначала образуется диазобензолсульфат (диазобензолсульфокислота):

Раствор тиамина при добавлении диазобензолсульфата и щелочи дает окрашенное соединение.

Ход работы. В пробирку последовательно добавляют:

0,9%-ный р-р сульфаниловой к-ты	5 капель	В мерной колбе:0,45г сульфанил к-ты в 4,5мл конц НСl, затем водой до 50 мл
5%-ный р-р NaNO2	5 капель	При добавлении к р-ру сульфаниловой к-ты образуется диазобензолсульфат
Вит.В1	Порошком на кончике скаль-пеля (или р-р), размешать
10%-ный р-р NaHCO3 (угле-кислая сода, бикарбонат) ИЛИ Смешать равные V 4%NaОН и 5,76% двууглекислого Na	5-7 капель	Появление желтого цвета, переходящего через 1-2 мин в красное. Если раствор соды осторожно приливать по стенке наклоненной пробирки, то на границе двух жидкостей образуется красное кольцо.

б) окисления в тиохром

Принцип метода. При действии K₃Fe(CN)₆ в щелочной среде тиамин окисляется в желтый тиохром, обладающий голубой флуоресценцией в УФ-свете.

Ход работы. 10 мг порошка тиаминбромида или тиаминхлорида растворяют в 5 мл воды, прибавляют 1мл 5%-го раствора железосинеродистого калия K₃Fe(CN)₆ (феррицианид калия) и 1 мл 10%-го раствора едкого натра, и перемешивают. Половину получившегося объема нагревают и наблюдают окрашивание в желтый цвет в результате превращения тиамина в тиохром. К другой половине добавляют 3 мл бутилового или изоамилового спирта, хорошо встряхивают и оставляют на несколько минут. Верхний, спиртовой слой дозатором отбирают в емкость из нефлуоресцирующего стекла и рассматривают в УФ-свете (можно – в лучах ртутно-кварцевой лампы в темном посещении). Хорошо заметна голубая флуоресценция.

в) снять спектр поглощения (модуль “спектральный”, диапазон от 350 до 220нм) и наблюдать максимум при λ=250-260 нм. График сохранить, перевести в Paint, затем вставить в файл “Графики” (документ Word), подписать и вклеить в отчет. ВНИМАНИЕ! Спектры всех витаминов снимать одновременно, чтобы включать и прогревать спектрофотометр только один раз.

УФ-спектр тиамина гидрохлорида (8 мкг/мл) в растворе HCl 0,9%. Максимум при 246 нм.

2. Витамин в2 (рибофлавин)

а) с металлическим цинком

Принцип метода. Рибофлавин восстанавливается выделяющимся водородом в бесцветный лейкофлавин. Наблюдается изменение окраски из желтой в зеленоватую, позже в малиновую, розовую, а затем – цвет исчезает.

Ход работы. В пробирку наливают 1мл взвеси рибофлавина в воде (0,015 - 0,025% раствор), добавляют 10 капель концентрированной HCl и опускают кусочек металическо-го цинка. Начинается бурное выделение пузырьков водорода, и жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, затем окраска жидкости начинает бледнеть и обесцвечиваться (обратное окисление лейкофлавина в рибофлавин).

б) с азотнокислым серебром

Принцип метода. Нейтральные или слабокислые растворы рибофлавина (рН 6,5-7,2), реагируя с AgNO₃, дают соединение розово-красных тонов. Интенсивность окраски зависит от концентрации витамина.

Ход работы. К 1 мл р-ра рибофлавина (0,015 - 0,025%) добавляют 0,5 мл р-ра AgNO₃ (0,1%). Появляется розовое окрашивание.

в) флуоресценция в УФ + ее тушение после добавления SnCl₂+Na₂S₂O₄, которые тушат флуоресценцию самого витамина, но не примесей. Флуоресценция рибофлавина максимальна при рН 3,5-7,5. Снять спектр в растворе ацетата натрия.

УФ-спектр рибофлавина (35 мкг/мл) в растворе ацетата натрия CH₃COONa

0,01%. Максимум при 266,5 нм. Дополнительные пики при 223,0 нм, 373,5 нм и 444,5 нм.

3. Витамин В₅ (РР, никотиновая кислота)

а) с ацетатом меди

Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с уксуснокислой медью образуется осадок медной соли никотиновой кислоты.

Ход работы. 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-го раствора уксусной кислоты (или готовят 0,75% р-р никотиновой кислоты в горячей воде, а затем к 2 мл этого р-ра добавляют 1 мл 15%-ного р-ра уксусной к-ты). К нагретому до начала кипения раствору добавить равный объем 5%-го раствора уксуснокислой меди. Жидкость становится голубоватой мутной, а при стоянии и охлаждении выпадает осадок никотината меди синего цвета.

б) на запах пиридина

Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с безводным Na₂CO₃ ощущается неприятный запах пиридина.

Ход работы. В небольшом сухом фарфоровом тигле смешивают 0,05 г никотиновой к-ты с 0,1-0,15 г безводного углекислого натрия и подогревают. Появляется резкий запах пиридина.

4. Витамин В₆ (пиридоксин)

а) с хлорным железом

Принцип метода. Витамин В₆ образует с хлорным железом комплекс кроваво-красного цвета.

Ход работы. 4 мл 0,5-1% р-ра пиридоксина + 0,5мл 1%-ного FeCl₃ → встряхнуть и наблюдать красный цвет.

б) ДОПОЛНИТЕЛЬНО –

в) снять спектр в 0,1М NaOH (наблюдать максимумы при λ=245 и 308 нм) или воде (см.рис).

УФ-спектр пиридоксина гидрохлорида (15мкг/мл) в воде (рН≈6,0). Максимум при 291 нм.

5. Витамин В₁₂ – оформить в отчете, на практике не делаем в связи с высокой токсичностью действующего реактива.

Части: 1) Плоское корриновое ядро из 4х пиррольных колец. В центре – атом Со, соединенный координационными связями с азотами пиррольных колец 2) Пятой координационной связью Со присоединяет к себе 5,6-диметилбензимидазол + рибозо-3’-фосфат (на рис. эта часть – снизу). 3) Шестой координационной связью Со присоединяет к себе 5’-дезоксиаденозин (на рис не показан).

Витамин В₁₂ реагирует с цианидом при рН=10 с образованием пурпурного дицианкобаламина, так как Со окисляется до 3х-валентного и 5’-дезоксиаденозин замещается на анион CN.