Экспрессный метод люминесцирующих антител для идентификации дрожжей, дрожжеподобных грибов и молочнокислых бактерий

Метод люминесцирующих антител (иммунолюминесцентный) предложен американским исследователем Кунсом в 1942 г. для диагностики болезнетворных микроорганизмов. Данный метод нашел широкое применение в медицинской микробиологии.

В основе метода люминесцирующих антител лежит реакция взаимодействия антигена с антителами, меченными люминесцирующим красителем. Антигенами называются белковые вещества, которые при введении в кровь животных или человека вызывают образование специфических защитных белковых молекул – антител. Другая особенность антигенов заключается в их способности вступать в реакцию с антителами, образовавшимися против данного антигена.

Микробные клетки являются антигенами. При иммунизации различными видами микроорганизмов в крови животных накапливаются специфические антитела. Образовавшиеся антитела можно выделить из крови и химическим путем соединить (конъюгировать) с люминесцирующим красителем. Чаще всего для этих целей применяют флуоресцеин тиоизоцианат (ФИТЦ), обладающий зеленым свечением. Таким образом получают меченые антитела.

При обработке иммунной сывороткой, содержащей меченые антитела препарата с микробными клетками, антитела соединяются с клетками гомологичного вида микроорганизмов, т. е. того вида, который использовался при иммунизации. С клетками других видов микробов (гетерологичных) реакция, как правило, не происходит.

Результатом положительной реакции антиген-антитело является образование светящегося ободка вокруг микробной клетки, что можно наблюдать при просмотре препарата под люминесцентным микроскопом. Клетки микроорганизмов окрашиваются таким образом, что средняя часть их значительно темнее краев. Яркий светящийся ободок по краю клетки представляют собой слой молекул антител, меченных люминесцирующим красителем.

Феномен светящегося ободка объясняется тем, что антитела располагаются мономолекулярным слоем на поверхности клетки. В результате этого при просмотре препарата по краям микробной клетки суммарная толщина слоя люминесцирующих антител в направлении луча зрения будет больше, чем в центральной части. А толщина слоя влияет на яркость люминесценции, поэтому края клетки светятся ярче. При неспецифической люминесценции антитела распределяются диффузно поверхности оболочки и клетка представляется равномерно светящейся.

Широко известны два варианта иммунолюминесцентного метода: прямой способ Кунса и непрямой способ Уэллера и Кунса.

Прямой метод заключается в том, что меченную люминесцирующим красителем иммунную сыворотку наносят на мазок с фиксированным антигеном. После окрашивания во влажной камере препарат промывают физиологическим раствором, высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом, выявляя клетки с характерным светящимся ободком.

При непрямой модификации окрашивание проводят в два этапа. Сначала на фиксированный мазок с антигеном наносят гомологичную немеченую сыворотку, полученную путем иммунизации кролика данным видом микроорганизма, но не соединенную с флуорохромом. Затем на промытый и высушенный препарат с нелюминесцирующим комплексом антиген-антитело наслаивают люминесцирующую антисыворотку, содержащую антитела против белков сыворотки кролика (например, ослиную антикроличью). После окрашивания препарат вторично промывают, высушивают и микроскопируют под люминесцентным микроскопом.

Опыт работы показал, что непрямой метод люминесцирующих антител по своей специфичности и чувствительности не уступает прямому методу окраски. В то же время непрямая модификация имеет существенное преимущество перед прямым способом, так как требует лишь одной люминесцирующей сыворотки – анти кроличьей, которая выпускается в готовом виде. Видовые сыворотки при этом не метятся флуоресцеином. Недостатками непрямого метода являются некоторое увеличение продолжительности анализа (на 30-40 мин) по сравнению с прямым методом и появление легкого свечения фона препарата вследствие свечения белков сыворотки, адсорбируемых на предметном стекле.

Для доказательства специфичности иммунной реакции антиген - антитело при использовании непрямого метода люминесцирующих антител обязательными контролями служат: обработка мазков с гомологичными и гетерологичными видами микроорганизмов иммунной антивидовой нелюминесцирующей сывороткой с последующим нанесением люминесцирующей антикроличьей сыворотки. При этом гомологичные виды должны специфически окрашиваться, а гетерологичные – не иметь люминесцирующего ободка; обработка мазков с гомологичными и гетерологичными видами микроорганизмов одной люминесцирующей антикроличьей сывороткой. Клетки микроорганизмов при этом не должны специфически окрашиваться.

Упрощение техники анализа, возможность получения результатов в короткие сроки при высокой точности определения делают целесообразным применение иммунолюминесцентного метода для выявления микроорганизмов промышленного значения.

Метод люминесцирующих антител стали испытывать в различных отраслях пищевой промышленности начиная с 60-х годов. Можно наметить три основных направления в использовании данного метода: обнаружение болезнетворных микроорганизмов в пищевых продуктах; выявление микробов - вредителей производства; контроль за развитием полезной микрофлоры.

Среди работ первого направления следует отметить ряд исследований по обнаружению в различных пищевых продуктах сальмонелл, дизентерийных бактерий, золотистого стафилококка, а также возбудителя ботулизма.

В области использования метода люминесцирующих антител для выявления нежелательной микрофлоры в ряде отраслей пищевой промышленности много сделано австрийским ученым Клаусхофером. Он применил данный способ контроля на сахарных заводах для экспрессного обнаружения в сиропе термофильных бактерий Вас. stearothermophilus, вызывающих большие потери сахара. Клаусхофер использовал иммунолюминесцентный метод для борьбы с пивной сарциной – опасным вредителем пивоваренного производства. Ричарде и Ковланд выявляли с помощью люминесцирующих сывороток различные виды диких дрожжей, загрязняющих пивные и спиртовые расы сахаромицетов. В дрожжевой промышленности метод люминесцирующих антител был успешно применен для обнаружения дрожжеподобных грибов, ухудшающих качество прессованных дрожжей. Положительные результаты получены также при исследовании возможности использования метода Кунса в микробиологическом контроле производства консервов с целью выявления термофильных бактерий – возбудителей плоскокислой порчи.

Метод люминесцирующих антител может быть применен не только для выявления вредителей производства, но и для контроля за развитием полезных микроорганизмов, принимающих участие в бродильных процессах.

Попытка такого рода была предпринята группой японских исследователей, изучающих процесс брожения соевой бражки. С помощью меченых сывороток они наблюдали за развитием Pediococcus halophilus, который играет важную роль в процессе созревания соевого сока.

Нами метод Кунса был использован для совершенствования микробиологического контроля хлебопекарного производства. Перспективность применения иммунолюминесцентного метода в хлебопекарной промышленности связана с тем, что основные виды дрожжей и молочнокислых бактерий, встречающихся в заквасках и тесте, отличаются антигенной обособленностью и могут быть выявлены с помощью люминесцирующих сывороток.

Результаты окрашивания люминесцирующими сыворотками основных видов дрожжей и дрожжеподобных грибов, встречающихся в хлебопекарном производстве.

Использование метода люминесцирующих антител позволило установить наиболее характерные для ржаных заквасок виды дрожжей сахаромицетов и молочнокислых бактерий и проследить за их развитием при продолжительном ведении закваски. Таким образом, данный метод оказывает существенную помощь при решении вопроса о целесообразности применения тех или иных видов в качестве чистых культур, а также при контроле чистоты производственных культур, хранящихся в музее. Была установлена возможность идентифицировать микроорганизмы непосредственно в субстрате, без предварительного выделения чистых культур, что значительно сокращает продолжительность анализа. Специфическими антисыворотками против дрожжей рода Candida можно быстро и без особых затруднений найти даже незначительное количество "диких" дрожжей в прессованных дрожжах, муке, закваске и тесте.

Приготовление и обработку препаратов иммунными сыворотками проводят согласно "Инструкции по микробиологическому контролю хлебопекарного производства методом люминесцирующих антител".

Исследуемые пробы полуфабрикатов предварительно разводят стерильной или прокипяченной водой в 1000 раз. Для этого берут 3 пробирки с 9 мл воды в каждой. 1 г закваски или теста вносят в первую пробирку и тщательно размешивают стеклянной палочкой; 1 мл суспензии из первой пробирки переносят пипеткой во вторую; из второй пробирки после перемешивания среды 1 мл переносят в третью пробирку. Из последнего разведения (1: 1000) пипеткой с хорошо оттянутым концом наносят небольшие капли суспензии (примерно 0,05 мл) на тщательно обезжиренное предметное стекло. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют 96%-ным этиловым спиртом в течение 5 мин. Затем на препарат наносят антивидовую немеченую сыворотку, предварительно разведенную до рабочего титра, т. е. предельного разведения, при котором сыворотка окрашивает гомологичную культуру микроорганизмов. Препарат помещают в чашку Петри и закрывают крышкой. Чтобы не допустить высыхания сыворотки, на дно чашки следует положить кусочек ваты, смоченной водой. Окраску продолжают в течение 20 мин при комнатной температуре. После этого сыворотку стряхивают с препарата и промывают его под слабой струей водопроводной воды в течение 3-5 мин или с помощью мешалки в сосуде с физиологическим раствором в течение 10-15 мин, чтобы удалить антитела, не вступившие в реакцию. Препараты подсушивают на воздухе и наносят на мазки люминесцирующую антикроличью сыворотку, также предварительно разведенную до рабочего титра. Окрашивание проводят во влажной камере (чашка Петри с влажной ватой) при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем препарат снова промывают, высушивают и просматривают под люминесцентным микроскопом.

Препараты исследуют с помощью окуляра 5Х и иммерсионного объектива 90X1,25, используя специальное нефлуоресцирующее иммерсионное масло с показателем преломления 1,520 или его заменители (диметилфталат, анизол, минеральное масло СО-110). В некоторых случаях, например при наблюдении за дрожжевыми клетками, применяют объектив водной иммерсии 40X0,65 или сухой объектив Д-0 40x0,65.

Микроскопирование проводят в видимом сине-фиолетовом свете (с максимумом излучения при длине волны 400-420 нм), который позволяет определять зеленый и желтый цвета и их оттенки, что важно при работе с сыворотками, меченными флуоресцеином. Для возбуждения сине-фиолетового света используют следующий набор светофильтров, входящих в комплект отечественной аппаратуры: входные светофильтры возбуждающего света - СС-4, СС-8, СС-14; теплозащитные сине-зеленые фильтры СЗС-7 или СЗС-14; окулярный защитный запирающий светофильтр Т-2Н, задерживающий избыточные синие лучи, которые засвечивают поле зрения микроскопа.

Такой набор светофильтров позволяет получить темное поле зрения с ярко светящимся объектом изучения. Микроскопирование осуществляют в падающем свете, что достигается с помощью опак – иллюминатора микроскопа.

При изучении препаратов, прежде всего, обращают внимание на характер свечения микробных клеток, цвет и степень – яркости специфической флуоресценции. В случае положительной реакции клетки микробов имеют ярко-зеленый светящийся ободок, а центральная часть клетки выглядит темной. Цвет и интенсивность свечения специфической флуоресценции клеток оценивают по общепринятой условной системе обозначения в крестах: сверкающая флуоресценция, четкий, яркий, зеленый ободок по периферии клетки; сама клетка темная; яркая флуоресценция, ободок желто-зеленого цвета, свечение менее интенсивное; слабое свечение периферии клетки, ободок неяркий, но еще различимый; слабо выраженная флуоресценция, ободок неотчетливый; отсутствие ободка, свечение клетки диффузное.

При люминесцентно – микроскопическом изучении препаратов закваски, обработанных сыворотками против разных видов микроорганизмов, можно ориентировочно проводить и количественный учет отдельных видов. Для этого в препарате просматривают 50 полей зрения, подсчитывая в каждом количество клеток с зеленым ободком, и суммируют их. Таким образом обрабатывают все препараты данного образца, окрашенные разными сыворотками. Для определения процентного содержания той или иной группы микроорганизмов в закваске количество клеток с ободком, обнаруженных видовыми сыворотками в 50 полях зрения, относят к общему количеству микробных клеток, подсчитанных в 50 полях зрения обычно приготовленного препарата, окрашенного метиленовой синью.

При соответствующем навыке работы результаты о видовом: составе микрофлоры исследуемых объектов могут быть получены в течение 1,5-2 ч после отбора проб.

Для работы по непрямому методу Кунса необходимо иметь в лаборатории люминесцентный микроскоп или люминесцентный осветитель к обычному биологическому, микроскопу, набор иммунных сывороток против микроорганизмов, подлежащих определению, и люминесцирующую антикроличью сыворотку.

Отечественная оптико-механическая выпускает люминесцентные микроскопы марки МЛ-2А, МЛ-2Б, МЛ-3 и люминесцентные осветители ОИ-18, ОИ-21.

Иммунные антивидовые сыворотки, предназначенные для выявления различных микроорганизмов, встречающихся в производстве пищевых продуктов, может изготовлять на договорных началах.

Сыворотки выпускаются в жидком виде в запаянных ампулах. Перед использованием сыворотку разводят до рабочего титра, т. е. предельного разведения, при котором сыворотка специфически окрашивает гомологичный вид.

Жидкая неразведенная сыворотка при хранении в холодильнике при 4°С не теряет активность в течение 1 – 1,5 лет. Титр сыворотки следует периодически проверять. Разведенную сыворотку нельзя хранить. Ее готовят каждый раз перед работой.

Люминесцирующая антикроличья сыворотка выпускается Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи в виде лиофильно высушенного порошка розового цвета, запаянного в ампулы. На этикетке коробки с ампулами указан объем сыворотки, количество дистиллированной воды для разведения и красящий титр, т. е. предельное разведение, при котором сыворотка специфически окрашивает гомологичные культуры. Сыворотки следует хранить при температуре 4°С. Сухие сыворотки при этом не теряют своей активности в течение нескольких лет; сыворотки, разведенные физиологическим раствором, сохраняются несколько месяцев.

Несмотря на явные достоинства, метод люминесцирующих антител не получил еще широкого применения в пищевой промышленности. Причинами этого являются главным образом недостаточная осведомленность работников промышленности о возможностях использования данного метода и отсутствие промышленного выпуска иммунных сывороток против полезной и вредной микрофлоры бродильных производств.

Введение метода Кунса в микробиологический контроль пищевых производств открывает новые и разнообразные возможности как для ускорения анализа, так и для проведения различного рода научных исследований.

Идентификация дрожжей методом иммунной реакции в туши

Гек и Новак предложили новую модификацию экспрессного определения различных видов дрожжеподобных грибов с помощью иммунных антивидовых сывороток. Метод состоит в обработке мазков исследуемой культуры смесью иммунной антивидовой сыворотки и специальной венгерской туши марки Folyekony kinai Hollotus (предприятие-изготовитель Роlitur es vegyitermek, Budapest). Прочие марки туши для этой цели не годятся.

По способу Гека на фиксированный препарат наносят одновременно одну каплю антивидовой нелюминесцирующей сыворотки, разведенной до рабочего титра, и две капли туши. Нанесенные ингредиенты смешивают и окрашивают препарат, в течение 1,5 мин. Затем препарат промывают смесью физиологического раствора и водопроводной воды со следами железа (в соотношении – 4 объема физиологического раствора и 6 объемов воды), высушивают на воздухе и микроскопируют под обычным световым микроскопом, используя иммерсионный объектив. В случае положительной реакции клетки дрожжей имеют черный ободок в результате включения частиц туши в комплекс антиген – антитело.

Метод Гека позволяет производить идентификацию дрожжеподобных грибов в течение нескольких минут. Другое преимущество данного способа экспресс-диагностики заключается в том, что он не требует наличия люминесцентного микроскопа и люминесцирующей антикроличьей сыворотки.